外泌體作為藥物載體在中樞神經系統疾病中的研究進展*

鄒俊清，丁網麗，胡君雅，黃 欣，張雪萌，**，朱君榮，**

1南京醫科大學附屬南京醫院（南京市第一醫院）藥學部，南京 210006；2中國藥科大學南京市第一醫院 藥學部，南京 211198

近幾十年來，腦內藥物濃度過低一直是中樞神經系統（central nervous system，CNS）疾病藥物治療發展的瓶頸。血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的存在和選擇滲透性是制約CNS 藥物進入腦內的主要因素[1]。因此很多治療藥難以到達大腦內，最終臨床轉化治療均以失敗告終。因此，迫切需要有效的藥物遞送系統（drug delivery system，DDS）來克服BBB 生理障礙，從而提高藥物療效并促進臨床轉化進程。

目前已經開發的一系列體外合成的脂質體和其他納米遞送系統仍存在一定的局限性，如在體內循環時易被肝和脾網狀內皮系統巨噬細胞吞噬，且在生物體液中的半衰期短，穿過BBB 時效率低、穩定性差、靶向性低[2，3]，因此在臨床轉化時受到阻礙。近年來研究人員將目光轉向內源性DDS——外泌體。外泌體起源于兩次質膜內陷過程：細胞質膜內陷形成早期內涵體，隨后早期內涵體膜繼續內陷，形成多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs），MVBs可以與溶酶體融合，導致其內容物酸化降解，也可以在與細胞質膜相融合時將腔內囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）作為外泌體釋放到細胞外空間[4，5]。外泌體具有一定的物質轉運功能，它具有脂質雙層膜，易于攜帶來自供體細胞的多種生物活性分子（如蛋白質、脂質和核酸），保護其不被降解并最終被輸送到受體細胞發揮生物學功能[6，7]。近年來多項研究表明外泌體可能是良好的天然DDS[8]：首先，外泌體具有良好的生物相容性及低免疫原性，特別是當外泌體來自患者自身細胞或某些特定種類的細胞如未成熟的樹突細胞及間充質干細胞時，幾乎無免疫原性，有利于發揮藥效和減少不良反應[9]；其次，特定的磷脂和功能性膜蛋白使其能夠高效地將內含物遞送到靶細胞的胞質中，如外泌體可通過膜融合或間隙連接等途徑向胞內遞送內容物，從而避開內涵體—溶酶體途徑，有利于提高遞送效率[10]；此外，體內某些外泌體具有很強的穩定性，可以避免巨噬細胞的吞噬作用，延長化學藥物的半衰期[11]；最重要的是外泌體的脂膜可以幫助穿越天然屏障如BBB，提高CNS 治療藥物腦內生物利用度[12，13]。因此，外泌體作為DDS 特別是作為良好的天然納米載藥系統為靶向治療CNS 等疾病提供了巨大潛力。本綜述將簡要介紹外泌體的載藥方式和作為腦部遞送載體的特性，以及作為核酸、蛋白質和化學藥物的遞送載體在CNS 疾病中的治療應用（圖1）。

圖1 外泌體作為核酸、蛋白質和化學藥物的遞送載體在CNS 疾病中的治療應用

1 外泌體載藥方式

理想的載藥方法不僅要實現較高的載藥效率，還應保留外泌體完整性和藥物的功能。目前，在不破壞外泌體膜完整性的情況下將藥物有效載入到外泌體中仍是一個巨大挑戰。現有的載藥方法可分為被動加載和主動加載。

被動方法比較簡單，它是基于藥物與外泌體或親代細胞孵育，并進一步分離含有藥物的釋放外泌體。藥物和外泌體直接孵育，操作方法相對簡單，但載藥效率取決于藥物的疏水性。對于一些疏水性小分子，因其能和外泌體膜的脂質層相互作用，故可通過簡單孵育的方法完成載藥，例如，將外泌體與疏水性姜黃素一起孵育可將姜黃素有效地裝載到外泌體中，包載效率為（18%±5%）[14]；外泌體的被動負載也可將親代細胞與藥物共孵育，使藥物進入細胞質，此方法只涉及對細胞的處理，而對提取的外泌體幾乎不進行處理，能較好地保留外泌體的完整性和功能性[15]。這種方法主要用于細胞毒性低的小分子化學藥物的負載，例如，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和紫杉醇孵育時，能夠使其包裝進入分泌的外泌體中[16]；巨噬細胞和姜黃素孵育時，姜黃素可以被包埋在外泌體中，載藥效率為14.5%[17]。然而，被動載藥的負載效率相對較低。

主動加載方法可以實現更高的加載效率，包括超聲、電穿孔、擠壓、轉染和凍融循環等。HANEY MJ 等[18]為將過氧化氫酶包載到外泌體中，對比了孵育、凍融循環、超聲和擠出幾種方法，發現不同處理方法的包載效率為：孵育＜凍融循環＜擠出≈超聲。此外，KIM MS 等[19]分別使用了孵育、電穿孔及溫和的超聲法將紫杉醇載入到外泌體中，結果證明超聲法載藥效率最高。然而，如無適當的實驗條件優化，外泌體的完整性可能會受到損害。

表1 總結了各載藥方式的優缺點，對于不同的藥物，應根據藥物的特性選擇合適的載藥方法，除了考慮載藥效率，外泌體膜的完整性和穩定性在藥物傳遞中也很重要。

表1 基于外泌體的藥物遞送系統的藥物加載技術的優缺點

2 外泌體載體種類

2.1 天然外泌體

外泌體具有基于供體細胞的天然靶向能力，不同細胞來源的天然外泌體可以靶向不同的細胞。外泌體表面配體與大腦內皮細胞受體之間的相互作用被認為是外泌體能夠穿越BBB 的主要機制，例如，YUAN D 等[20]發現幼稚巨噬細胞（naive macrophage，M?）外泌體可以通過外泌體上整合素淋巴細胞功能相關抗原1、細胞間粘附分子1 和腦微血管內皮細胞上的碳水化合物結合性C 型凝集素受體之間的相互作用穿過BBB 進入腦內。此外，QU M 等[21]發現來自血液的外泌體也顯示出天然的腦靶向能力，涉及轉鐵蛋白—轉鐵蛋白受體相互作用，其能夠通過轉鐵蛋白受體介導的內吞作用穿過BBB；而QI Y 等[22]發現血漿外泌體可通過外泌體的熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）與腦血管內皮細胞Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）之間的特異性主動靶向穿越血腦屏障。除了通過穿過BBB的方式進入腦組織，GRAPP M 等[23]發現外泌體也可以通過穿越脈絡叢中的腦脊液—腦屏障進入大腦，脈絡叢上皮細胞產生的外泌體含葉酸受體-α（folate receptor-α，FRα），可以穿過室管膜細胞層并分布到腦實質中，從而被星形膠質細胞和神經元攝取，表達FRα 的外泌體選擇性靶向腦實質的特性為腦部藥物遞送提供了一種新途徑。

2.2 工程化外泌體

雖然部分天然外泌體能夠靶向大腦，但經靜脈注射后，來自骨髓的樹突狀細胞（dentritic cell，DC）和MSCs 的未修飾外泌體在網狀內皮系統器官（如肝臟和脾臟）中快速積累，很少能夠被遞送至大腦[24，25]。天然外泌體的低特異性靶向能力和尺寸依賴性嚴重影響細胞對外泌體的攝取[26]，而對外泌體表面進行修飾可以很好地提高其靶向能力。工程化修飾分為供體細胞工程和外泌體工程，前者是通過基因工程和化學方法對供體細胞進行改造，在外泌體生物發生時直接對外泌體進行修飾[27]。例如，狂犬病病毒糖蛋白（rabies viral glycoprotein，RVG）肽能夠特異性結合乙酰膽堿受體并在神經內皮細胞和神經元細胞上表達[28]，將RVG 肽序列和編碼溶酶體相關膜糖蛋白 2b（lysosomal -associated membrane protein 2b，Lamp2b）構建的質粒引入未成熟DC，RVG 肽與Lamp2b 融合并在DC 衍生的外泌體表面富集，從而產生修飾的RVG-Lamp2b 外泌體，修飾后的外泌體在小鼠體內顯示出穿越BBB的能力及良好的靶向效率[9]。外泌體工程則是在適當的條件下，使用特定的技術對純化的外泌體表面蛋白或內容物進行修飾，例如化學合成的c 肽[cyclo（Arg -Gly -Asp -D -Tyr -Lys）peptide，c（RGDyK）]對整合素αvβ3 具有高親和力，通過點擊化學將其結合到外泌體表面，工程化的c（RGDyK）綴合外泌體能夠成功地靶向缺血損傷區域，并在短暫性大腦中動脈閉塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）小鼠模型的神經元和星形膠質細胞中高度富集[29]。

3 外泌體遞藥系統在CNS 治療中的應用

3.1 缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）

缺血性腦卒中起病急驟并伴隨嚴重的神經功能缺損，約占腦血管病發病的80%[30]。依達拉奉（edaravone，Edv）在臨床上主要用于改善IS 腦受損程度，然而，Edv 的半衰期短和生物利用度低導致其治療效果有限[31，32]。因此，LI F 等[33]開發了含有Edv的巨噬細胞衍生外泌體（Exo+Edv），發現外泌體顯著提高了Edv 的腦內生物利用度，與游離Edv 組相比，Exo+Edv 組顯示出更高的最高血藥濃度（Cmax，0.493 vs 0.824 mg·L-1）和更大的藥時曲線下面積（AUC，0.172 vs 0.583 mg·L-1·h），同時半衰期延長（t1/2，3.301 vs 4.842 h）。在外泌體的介導下，更多Edv 到達腦缺血部位并定位于神經元細胞和小膠質細胞，從而減少神經元細胞的死亡，同時促進小膠質細胞從M1 表型向M2 表型轉變，增強卒中模型小鼠的神經保護作用。

在IS 藥物靶向治療中，外泌體除了裝載神經保護藥物外，也可針對卒中可能的致病機制所涉及的通路蛋白進行包載。改善星形膠質線粒體的功能和促進健康的星膠線粒體向神經元的轉移可能是減少IS 誘導的神經元損傷的有效治療方法，其關鍵蛋白線粒體動力相關蛋白1（dynamin-related protein-1，Drp1）/線粒體分裂蛋白1（fission 1，Fis1）或可作為潛在治療靶點[34-36]。七肽（heptapeptide，Hep）是一種Drp1/Fis1 肽抑制劑[37]，然而作為一種蛋白質藥物存在易被酶降解、循環半衰期短和膜通透性差的問題[38]。LIU W 等[39]制備了載有Hep 的巨噬細胞衍生外泌體（EXO-Hep），發現外泌體能夠幫助Hep 穿過BBB，靶向腦缺血部位，并實現Hep 在活化星形膠質細胞中的分布。EXO-Hep 通過抑制星形膠質細胞的線粒體過度分裂，促進健康星形膠質細胞線粒體向神經元轉移，從而顯著減少tMCAO 小鼠的腦梗死面積并改善其受損神經功能。

3.2 脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）

脊髓損傷會造成運動神經元的不可逆喪失，導致運動、感覺功能障礙以及不同程度的癱瘓[40]。磷酸酶和緊張素同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是軸突生長的主要內在障礙之一，抑制PTEN 表達可促進中樞神經再生，為SCI 的治療提供了新興治療策略[41，42]。然而，PTEN 抑制劑如RNA 干擾（RNAi）的遞送由于BBB 的存在、核酸酶降解敏感性以及細胞特異性靶向性差而受到阻礙[43]。GUO S 等[44]開發了裝載PTEN-siRNA 的MSCs外泌體，通過神經炎癥介導的趨化性靶向脊髓損傷區域，對病變區域的神經元具有高親和力，促進PTEN-siRNA 在脊髓損傷中發揮作用，鼻內給藥后SCI 大鼠獲得了顯著的運動改善、感覺恢復和更快的尿反射恢復，同時伴隨著神經炎癥和膠質細胞增生減少、軸突再生和血管生成增加以及結構和電生理改善等生物學變化。

自噬在SCI 后的繼發性損傷修復中發揮了重要作用[45，46]，白藜蘆醇（resveratrol，Res）能夠在多 種神經系統疾病中激活自噬[47]，可有效激活脊髓損傷后的自噬和促進神經修復[48]，然而，Res 在脊髓中的藥物濃度較低。FAN Y 等[49]將Res 成功加載到小膠質細胞分泌的外泌體（Exo-Res）中，提高了Res 的穩定性并減慢了其降解速率，并增強Res 通過BBB的滲透，從而增加其在CNS 中的濃度。Exo-Res 通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號通路增加自噬誘導并抑制神經元凋亡來改善SCI 大鼠的運動功能。

3.3 阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）

阿爾茨海默病是最常見的神經退行性疾病，其特征是進行性認知損傷和記憶喪失，是一種病情進展緩慢的腦部疾病[50]。水飛薊素（silibin，Slb）可在減少淀粉樣蛋白-β（amyloid-β，Aβ）聚集和使星形膠質細胞失活方面發揮雙重治療作用，以改善AD 動物模型的行為和認知能力[51]，然而，腦靶向性差和生物利用度低限制了其應用。HUO Q 等[52]將Slb 封裝在巨噬細胞衍生的外泌體（Exo-Slb）中，Exo-Slb 進入大腦后，高選擇性結合Aβ1-42，并抑制Aβ1-44的聚集；同時，Exo-Slb 在星形膠質細胞中被內化以抑制激活，并通過調節核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路減輕星形膠質細胞介導的神經元損傷，有效改善了AD 小鼠的認知缺陷。

與水飛薊素相似，槲皮素（quercetin，Que）在AD 治療中也面臨著一些溶解度差、生物利用度低、難以穿過大腦的問題[53]，Que 能防止tau 蛋白病變，抑制淀粉樣蛋白的產生，并誘導與自噬有關的神經保護[54]。QI Y 等[22]開發了負載Que 的血漿外泌體（Exo-Que），血漿外泌體通過HSP70 與TLR4 之間的特異性主動靶向，穿越血腦屏障，促進藥物腦遷移，增加了Que 的腦靶向性和生物利用度。與游離Que 相比，EXO-Que 的藥代動力學特征顯著增強，半衰期延長（Cmax，1.31 vs 2.5 mg·L-1；t1/2，36.47 vs 89.14 min）。外泌體對AD 小鼠的記憶缺損具有協同神經保護作用，因此與游離Que 相比，Exo-Que 具有更強的抗凋亡作用，更顯著地抑制周期蛋白依賴性激酶5 介導的tau 磷酸化和減少不溶性神經纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）的形成，更好地改善AD 模型的小鼠認知能力。

3.4 帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）

帕金森病是第二大最常見的神經退行性疾病，PD 發生的主要原因通常被認為是多巴胺能黑質神經元的喪失，以及黑質殘存神經元胞質內出現嗜酸性包涵體，即路易小體（Lewy bodies，LBs）[55]。PD 通常通過注射多巴胺來治療，但由于BBB 的存在，多巴胺未能有效地輸送到大腦[56]，因此，需要可直接包裹多巴胺的DDS，使其以最大的生物相容性和最小的毒性有效穿過BBB。QU M 等[21]采用改進的飽和溶液孵育法，通過最大濃度差促進多巴胺被動滲透到血液外泌體中，以提高血液外泌體的載藥效率，該方法的載藥效率為（15.97%±0.22%）；同時，利用血液外泌體的大腦靶向能力，多巴胺被有效地輸送到大腦，包括紋狀體和黑質，大腦中累積的多巴胺濃度為（1.02±0.15）nmol·g-1，是游離多巴胺的15倍。負載多巴胺的外泌體在PD 小鼠模型中顯示出更好的療效，能夠改善多巴胺能神經元丟失和PD小鼠的神經行為功能，并且系統毒性更低。

α-synuclein（α-syn）是LBs 的主要成分，α-syn的聚集導致線粒體功能失調，加速氧化應激，并導致多巴胺能神經元的退化[57]，因此，降低α-syn 表達的策略為減緩PD 的進展提供了有希望的治療途徑。雖然反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）可以降低α-syn 的表達，但仍然無法將ASOs安全有效地傳遞到神經元。YANG J 等[58]利用外泌體開發了一種安全高效的ASOs 遞送方法，用骨髓來源的間充質干細胞（hbmMSC）外泌體包載ASO4（Exo-ASO4），研究發現Exo-ASO4 可到達PD 模型小鼠的腦實質，包括皮層、海馬區、紋狀體和大腦，并明顯減少α-syn 的表達并減弱其聚集程度，因此，外泌體包載外源性ASO4 進入腦內顯著改善了PD 模型小鼠多巴胺能神經元的退化及運動功能障礙。

4 總結與展望

外泌體作為人體內源性成分，具有納米級大小、低免疫原性、先天穩定性、高遞送效率和穿過BBB 的能力，與其他DDS 相比具有明顯優勢。雖然外泌體作為載藥系統在CNS 疾病治療中具有很大潛力，但要想將這一載藥系統應用于臨床治療仍存在許多問題，例如目前應用外泌體裝載藥物的實驗技術手段依然有限，天然外泌體的產量較低且易被自身免疫系統清除，通過表面修飾實現外泌體的高效靶向并非易事，需要嚴格控制反應條件，避免外泌體的聚集和破損。雖然大量實驗已證實，多數細胞產生的外泌體均能有效載藥，且在一些疾病的治療中（尤其是腫瘤治療）效果顯著，但針對不同疾病如何選擇合適的細胞作為外泌體的來源，如何高效地裝載治療藥物仍需要深入研究；此外，對于不同來源細胞外泌體進入大腦方式是否一致以及進入大腦后藥物何時被釋放以發揮作用還不夠清晰，闡明上述問題將對外泌體介導的腦部藥物遞送和CNS 疾病的治療產生重要影響。隨著實驗技術手段的不斷完善以及外泌體大規模生產方式的出現，外泌體作為納米載藥系統將會成為治療CNS 疾病的一種有效工具。