以生物標志物為導向的臨床試驗研究*

宋佳麗 孫鳳宇 劉芝霖 李 康 侯 艷△

近年隨著精準醫療的發展,越來越多的藥物針對疾病的分子作用機制和特定靶點進行開發。在創新藥物研發上,以生物標志物為導向的臨床試驗研究,即探索與藥物療效或安全性相關的生物標志物,根據其識別亞組并制定個體化治療的臨床試驗方案,從而使患者接受更有益的治療、加速藥物研發進程、最大限度地規避新藥研發的風險,已引起人們的極大關注[1-3]。本文將對以生物標志物為導向的臨床試驗設計方法和特點進行簡要綜述,以期對創新藥物研究起到一定的助力作用。

生物標志物在臨床試驗中的作用

生物標志物(biomarker)是指在正常生理、病理過程中的某些指標,或對暴露或治療干預措施產生的某種應答或反應,其通常能夠進行客觀測量和評價,主要包括分子、組織學、放射學或生理學等特征[4]。2016年,美國食品藥品監督管理局(food and drug administration, FDA)和美國國立衛生研究院發布了生物標志物、結局指標和其他工具(biomarkers, endpoints, and other tools, BEST)術語表等[5]。其中根據功能定義了七種生物標志物,即診斷、監測、藥效學/反應、預測型、預后型、安全性、易感性/風險生物標志物。中國國家藥品監督管理局藥品審評中心2021年6月發布了《生物標志物在抗腫瘤藥物臨床研發中應用的技術指導原則(征求意見稿)》[6],其中定義了六種生物標志物。相比之下,美國FDA多了易感性/風險生物標志物。一個生物標志物在不同的應用場景下,可能具有不同的功能,從而會歸屬于不同的分類。以生物標志物為導向的臨床試驗研究最常使用的是預測型和預后型生物標志物,前者主要指能夠鑒別對研究藥物最可能有應答反應的生物標志物,后者則是指更有可能觀察到終點事件或疾病進展的高風險人群的生物標志物。

以生物標志物為導向的臨床試驗研究的關鍵是,通過合適的生物標志物確定亞組人群。此時,相關標志物檢測方法的可靠性十分重要。理想情況下,試驗中生物標志物的檢測方法,應該對高風險或藥物敏感者(目標患者)有較高的靈敏度,同時對低風險或對藥物無應答者(非目標患者)有較高的特異度。如果檢測方法的靈敏度差,則目標患者被篩選入組的可能性降低,從而延緩整個研究入組的進度;如果檢測方法特異度較低,則選入的非目標患者可能較多,從而稀釋了藥物的治療效果。針對生物標志物的檢測方法可以研發出伴隨診斷產品(companion diagnostic, CDx)。目前已有FDA批準的CDx用于指導精準用藥[7]。CDx通常是一種體外醫療設備,可為專業人員提供相關信息,保障安全、有效地使用相應的藥品或生物產品,常用于確定:(1)最有可能從治療中受益的患者;(2)可能因接受治療而導致嚴重不良反應風險增加的患者;(3)對治療安全且有效的患者。目前,CDx可以與藥物研發同步進行,或在藥物上市后進行開發。

臨床試驗生物標志物的識別與確證

生物標志物的識別可以通過回顧性或前瞻性研究獲得相關信息,并運用多種統計學或機器學習方法進行分析?；诩韧芯繑祿R別生物標志物是一種回顧性研究,即主要使用已經完成的各種臨床試驗數據,包括隨機對照試驗(randomized controlled trial,RCT)或隊列研究數據進行一個或一組生物標志物的識別。通過回顧性分析,找到相關的生物標志物及其陽性患者亞組治療有效的證據,這在一定程度上避免了倫理學上的問題。此外,也可利用失敗的臨床試驗中采集到的血液或組織學樣本,結合最新研究進展,進行新的生物標志物檢測及分析探索,隨后通過富集設計進一步研究,有可能使藥物因亞組人群獲益而批準上市。例如,一項轉移性結直腸癌患者的隨機Ⅲ期臨床試驗中,預測型生物標志物KRAS可用于預測帕尼單抗(panitumumab)和西妥昔單抗(cetuximab)的療效。對該項目進行回顧性分析發現,92%患者可評估KRAS狀態,其中43%具有KRAS突變。針對無進展生存期指標,在野生型和突變亞組人群中,帕尼單抗治療相較于最佳支持治療的風險比(hazard ratio, HR)分別為0.45(95%CI: 0.34～0.59)和0.99(95%CI: 0.73～1.36)[8],為KRAS野生型亞組的治療有效性提供一定的證據支持。值得注意的是,如果使用來自兩個或以上獨立RCT數據進行回顧性分析,其獲得的結果證據力度更強。生物標志物的前瞻性研究主要是根據早期研究中確定的、具有已知病理生理效應的蛋白質或遺傳標志物,或者根據Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中標志物分析結果等,進一步通過確定閾值等方法,預先進行設計,對已經識別出的潛在生物標志物進行探索或驗證。

以生物標志物為導向的試驗設計

使用前瞻性試驗驗證藥品或醫療器械有效性和安全性的力度遠大于回顧性研究。目前已經開發并使用了多種以生物標志物為導向的前瞻性臨床試驗策略及設計方法,主要有簡單富集設計(classical enrichment design)、納入所有受試者設計(all-comers design)、適應性富集設計(adaptive enrichment design)以及主方案設計(master protocol design)等。

1.簡單富集設計

即僅對最有可能從治療中受益且具有特定分子特征的患者進行研究,其主要思想是在臨床試驗中根據受試者的生物學特征,前瞻性地識別或定義從研究藥物中獲益最大的目標人群,從而提高臨床試驗效率的一種策略和設計方法(圖1)。比如抗腫瘤治療藥物通常針對癌細胞表面或細胞內相關的受體、酶、激素或其他內源活性物質,對此可將一個或多個相應的生物標志物作為選擇富集人群的依據。例如,對于人表皮生長因子受體2(HER2)蛋白陽性的乳腺癌手術切除患者,使用曲妥珠單抗(trastuzumab)聯合紫杉醇(paclitaxel)治療,能夠顯著提高其無病生存期[9]。一般而言,僅以標志物陽性受試者為目標人群,需要充分說明該亞群患者可以從研究藥物中獲益,而生物標志物陰性的患者不會從該治療中受益,即藥物對標志物陰性患者無效或存在安全性問題[10]。常見的設計主要包括:(1)通過預后型生物標志物,識別更有可能或更快觀察到終點事件的高風險人群;(2)根據預測型生物標志物,選擇最有可能對研究藥物應答或對現有對照藥物無應答的受試者;(3)同時使用預后型和預測型標志物以減少受試者和試驗結局的異質性。

圖1 簡單富集設計示意圖

2.納入所有受試者設計

如果藥物的作用機制或已有數據表明,生物標志物陽性患者較陰性患者的療效更好,在治療毒性較小的情況下,可同時納入生物標志物陽性和陰性的患者。這種策略的優點是,能在非富集人群中進行合理的獲益-風險評估,避免了由于標志物陽性人群獲益較高而得出全人群獲益的結論,貽誤原本沒有或較小獲益的標志物陰性人群的治療[11],主要包括:

(1)順序檢驗策略設計(sequential testing strategy design):這種設計將標志物陽性和陰性患者同時納入試驗,但是需要預先設定研究假設。其主要包括兩種檢驗策略:(1)先在全人群中檢驗研究藥物和對照組是否有差異(H0(2)),如果在預設的檢驗水準α1下,差異沒有統計學意義,則使用初始設定的檢驗水準α2,在預定義的標志物陽性亞組中進行檢驗(H0(1));(2)先在標志物陽性亞組中進行檢驗(H0(1)),若差異有統計學意義,進一步在整個人群中進行檢驗(H0(2))(圖2),同時應該注意控制總Ⅰ類錯誤概率[12]。當假設治療對整體有效,亞組分析僅作為補充分析時,一般推薦使用前者;當有較強的證據支持在生物標志物陽性亞組中的治療效果更好,且能夠入組足夠的標志物陽性人群時,建議使用后者。檢驗的具體方法可有Bonferroni單步檢驗法、逐步多重檢驗法(stepwise multiple procedure)和回退法(fallback procedure)等。

圖2 順序檢驗策略設計示意圖

(2)生物標志物分層設計(biomarker-stratified design):即根據生物標志物狀態分層隨機化,將患者分配到不同的干預組中(圖3),根據標志物分層隨機化可以確保參與研究的不同生物標志物患者都能接受到治療,且能夠更好地保證組間均衡[13]。該設計預先定義一個或一組目標生物標志物,并對具有生物標志物檢測結果的患者進行前瞻性分層隨機化。其更適用于有候選生物標志物,但前期沒有充分證據支持只納入標志物陽性人群的情況。一個典型的案例是厄洛替尼(erlotinib)在非小細胞肺癌(NSCLC)中的生物標志物驗證試驗(MARVEL)。之前研究發現表皮生長因子受體(EGFR)可能是治療NSCLC的重要生物標志物[14],故該試驗根據EGFR免疫組化測量結果將二線治療患者隨機分配至培美曲塞(pemetrexed)或厄洛替尼治療組。本設計同樣有兩個研究假設,即針對全人群和標志物陽性亞組人群,可以使用前述的任一種多重檢驗方法進行檢驗。

圖3 生物標志物分層設計示意圖

(3)混合設計(hybrid design):若開展試驗前有充分且有力的證據表明,試驗治療對生物標志物陰性亞組有不利影響,或在該亞組中可能存在過度毒性時,將這一類亞群患者隨機分配接受不同組別治療,或使其退出試驗顯然不符合倫理,此時可以考慮使用混合設計[15](圖4)。該設計在生物標志物陽性亞群中進行隨機化,能夠檢驗研究藥物在該亞組中的效果,類似于生物標志物分層設計。然而,與其不同的是,生物標志物陰性亞群均接受標準治療。此外,當事先存在可信的證據證明相關生物標志物陽性亞組存在療效時,也適合選擇這種設計,對具有某特定標志物的患者隨機分配治療?；旌显O計主分析主要針對生物標志物陽性亞組,而生物標志物陰性亞組僅作為輔助分析使用。

圖4 標志物陽性和陰性受試者皆獲益的混合設計

3.適應性富集設計:若在設計階段對于靶向生物標志物了解不充分,如研究藥物在生物標志物陽性患者人群中的療效、陽性患者在目標人群中的比例等具有較大的不確定性,則可以使用一種更為靈活的試驗設計方法,即適應性富集設計[16]。其前瞻性地規定如何根據期中分析結果對后續實踐過程進行修改,包括減少或限制標志物陰性亞組患者入組等[17],方便在試驗后期調整相應內容(圖5)。常見的設計類型有:

圖5 適應性富集設計示意圖

(1)適應性調整患者入組條件(adaptive patient enrollment modification):一項隨機對照試驗可以同時入組生物標志物陽性和陰性的患者,在主要終點是標志物陽性亞組的療效時,若期中分析結果顯示標志物陰性患者人群治療效果遠低于標志物陽性患者的療效,則可減少或完全停止標志物陰性的患者入組[18]。然而,對于早期探索性研究,最好同時納入該預測型生物標志物陰性的患者,從而評估藥物在整體患者人群中的獲益與風險。當無法確定一個生物標志物是否具有預測作用時,主要終點可以是全人群中的效應。

(2)適應性閾值策略(adaptive threshold strategy):假設在試驗開始時有一個預先指定的生物標志物檢測,期望找到一個閾值,將連續變量轉換成二分類分組變量,使得按這個分組變量劃分的兩個組別的療效差異最大[19]。由于定義亞組的界值可能并不確定,可以首先比較研究藥物組和對照組所有患者療效,如果在預先指定的檢驗水準α1下得出兩組差異顯著的結論,則認為研究藥物對所納入的患者整體有效。否則,使用預先確定的檢驗水準α2進行第二階段檢驗,尋找最佳判定閾值,使生物標志物陽性患者和陰性患者間的療效差異最大化。

(3)適應性特征設計(adaptive signature design):此設計常在方案中事先制定研究策略與Ⅰ類錯誤控制方法等,并進行一系列的統計建模與分析,獲得關于標志物的預測特征。例如,使用多個生物標志物建立預測藥物敏感性的分類器,在期中分析時分析預先規定的終點,確定最佳的診斷閾值。該方法需要將數據分為訓練集和測試集,使用訓練集定義最有可能從研究藥物治療中獲益的患者特征,然后對測試集中具有該特征的患者的療效進行評估[20]。

(4)適應性無縫設計(adaptive seamless design):即將幾個原本獨立的試驗組合成一項研究的試驗設計,該設計使用全部數據進行最終分析,可同時滿足幾個試驗目的[21]。常見的兩階段適應性無縫設計通常包括學習階段和確證階段。學習階段可對生物標志物進行探索,并根據累積的數據在本階段結束時調整后續試驗設置;確證階段著重對上一階段發現的生物標志物亞群早期療效進行驗證[22]。相較于傳統方法,本設計可以減少各研究階段的間隔時間,并充分利用從試驗中收集到的所有數據評估藥物療效。

4. 主方案設計

主方案設計是指在一個臨床試驗中,同時對多個患者群(如不同的腫瘤)進行評估,或同時研究多種藥物對一種疾病的療效,需要預先設計一個具有多個目標的總體方案[23],其主要包括以下幾種設計。

(1)籃式試驗設計(basket trial design):該設計針對具有相同生物標志物特征的多種疾病或組織學類型患者,可視為多個單病種富集試驗的組合,目前常用于抗腫瘤藥物研究[24]?；@式設計僅納入生物標志物陽性患者,并對其進行隨機化分組或使用單臂研究,目前常用的是Ⅱ期單臂設計。然而,單臂研究一般要求主要終點是客觀指標,因為在沒有對照組時,通常認為客觀指標的可解釋性更強。例如,使用籃式設計對威羅非尼(vemurafenib)治療BRAFV600突變的多種非黑色素瘤癌癥療效和安全性進行探索,其主要終點為影像學的客觀緩解率[25]。

需要注意的是,在具有相同生物標志物的不同疾病或組織學類型患者間,研究藥物可能存在一定的療效差異。例如使用威羅非尼治療BRAFV600突變患者時發現,當原發部位是黑色素瘤時治療反應很高,而當患者原發部位是結直腸癌時,治療反應卻很低[25]。因此,對于籃式試驗設計的研究,主分析一般是對不同的疾病或組織類型單獨分析,然后在此基礎上再進行綜合分析。

(2)傘式試驗設計(umbrella trial design):主要針對單一疾病或組織學類型患者進行多種治療的有效性和安全性評估。該設計需要預先制定并評估一個明確的規則,通過規則匹配生物標志物人群和候選治療方案。在檢測患者生物標志物后,根據生物標志物種類和規則將患者分配到其對應的特異性部分試驗中,各部分試驗可以使用單臂或隨機分組設計。一個典型例子是整合生物標志物的肺癌靶向治療方法評價(BATTLE),該試驗使用傘式設計在進展性NSCLC患者人群中,以四種生物標志物為導向,研究三種單抗和一個聯合療法治療效果[26]。

(3)平臺試驗設計(platform trial design):融合了籃式試驗和傘式試驗的特點,可針對多種疾病或組織學類型評估多種臨床研究藥物或藥物聯合方案,從而找到某種疾病的最佳治療方法[27]。這種設計方案具有很大的靈活性,有助于停止無效或不良反應發生率高的試驗、盡快推進有利的早期結果至Ⅱ/Ⅲ期研究、引入新的部分試驗研究等。在一項基于影像學和分子生物標志物確定局部晚期乳腺癌的新輔助治療方案的研究(I-SPY 2)中[28],利用平臺設計在三種生物標志物定義下的八個早期高風險亞組人群中,探索五種藥物的治療效果。

基于生物標志物臨床研究的一般考慮

1. 生物標志物的證據強度

當預期使用以生物標志物為導向的臨床試驗設計時,需要對潛在預測/預后型生物標志物的臨床前證據強度進行評估,以支持試驗設計方法的選擇。如果有較強的證據表明,試驗治療不能為所有患者提供益處,且僅限于生物標志物陽性患者獲益,即治療在生物標志物陽性人群中的應答率更高,或在生物標志物陰性患者中具有較大的毒性,則可以采用富集策略。否則,更適合納入所有受試者的策略,避免錯過可能獲益的受試者,使藥物具有更大的獲益人群。

2. 生物標志物陽性率及其檢測方法

在進行以生物標志物為導向的臨床試驗設計時,首先應該充分考慮生物標志物陽性人群在全人群中所占比例。如果比例過低,使用富集設計容易造成臨床試驗受試者招募困難,延長試驗時間,不利于臨床實施與執行,也會增加資源消耗,需要謹慎決策;如果比例過高,可能不需要進行富集試驗設計,此時傳統的臨床試驗方案更簡單易行,且有更大的適應癥人群。其次,為了準確識別出生物標志物陽性和陰性人群,應選擇較高靈敏度和特異度的檢測方法,且該技術應具有較好的有效性和重現性。最好在試驗設計過程中,考慮對伴隨診斷產品進行同步開發和驗證。

3. 臨床試驗設計與執行程度

以生物標志物為導向的臨床試驗設計均具有較高的靈活性,因此能夠鎖定獲益人群,加速藥物開發速度。但是,如果在試驗設計時對各種可能的情況及其相關解決措施考慮不周,或在試驗實施過程規范化管理與質控上做得不夠好等,極有可能導致試驗數據質量差,用其分析得到的結論與事實相反,反而不利于患者受益。因此,需要建立相關規范文件,明確在臨床試驗各個階段應充分考慮的問題。

4. 總Ⅰ類錯誤概率控制

以生物標志物為導向的臨床試驗研究在統計檢驗時,可能出現Ⅰ類錯誤概率膨脹問題,即由于在全人群和亞組人群中進行多次檢驗,使得治療雖在研究人群中沒有效果,卻錯誤地得出療效顯著的統計結論。因此,必須使用合適的方法對其進行控制。當有充分證據表明生物標志物陽性亞組的療效優于全人群療效時,可以考慮使用固定檢驗順序的方法(如守門法),即在α水平檢驗亞群療效,若有顯著意義則仍在α水平檢驗全人群療效,否則停止檢驗[29];在沒有足夠的數據用來估計亞組和全人群的療效時,可以考慮使用逐步多重檢驗法(如Hochberg和Hommel法)[30]或回退法[31]。

5. 知情同意書可理解性

相較于傳統設計,以生物標志物為導向的臨床試驗設計常較為復雜、不容易解釋,導致此類知情同意書篇幅通常較長,往往無法保證所有入組患者完全理解知情同意書中的相關內容,需加強患者的知情同意教育[32-33]。為此,可在早期讓患者或試驗中心參與知情同意書的審閱,使其盡量簡化以便入組受試者理解;當設計有多個階段或部分試驗時,可讓患者分別簽署兩個知情同意書,其中一個主要闡明治療階段或入組的情況,另一個則主要告知患者治療可能獲得的受益與風險。

展 望

目前,加快從實驗室到臨床應用的藥物研發是臨床研究發展的必然趨勢?；谇捌谒幚砗投纠韺W等探索,充分認識患者的異質性,并通過伴隨診斷產品輔助以生物標志物為導向的臨床設計實施,可提高試驗效率,對于加速藥物研發起著關鍵作用。這種研究還可以在臨床試驗過程中尋找新的替代終點,縮短臨床試驗周期;或輔助研究者找到藥物的敏感人群與獲益人群,使更多人更早獲益,并加速藥物上市;同時,可以識別對藥物治療無效或安全風險較高的患者,減少其不必要用藥與損傷。然而,由于生物系統的復雜性,如何準確找到相應的生物標志物,仍面臨巨大的挑戰。相信隨著以生物標志物為導向的臨床試驗實施增加,會不斷批準更多的創新藥物。