高效液相色譜法同時測定人工牛黃甲硝唑膠囊中甲硝唑和膽紅素含量*

陳 路，李 苗，黃金秋，蘭 彤，宮立孟△

（1.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所·國家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑質(zhì)量研究與控制重點實驗室，湖北 武漢 430075；2.湖北生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術研究院有限公司，湖北 武漢 430073）

人工牛黃甲硝唑膠囊對急性智齒冠周炎、局部牙槽膿腫、牙髓炎牙根炎療效較好［1-2］。該方主要由人工牛黃和甲硝唑組成，其中人工牛黃主要成分有?；撬?、牛膽粉、膽紅素等，有清熱解毒、化痰定驚功效［3-5］。膽紅素是制劑質(zhì)量的評價指標之一。2020 年版《中國藥典》暫未收載人工牛黃甲硝唑膠囊的質(zhì)量標準，本品現(xiàn)行標準為《國家藥品標準·化學藥品地方標準上升國家標準》，其中甲硝唑與膽紅素的含量需分別測定，操作煩瑣。且測定甲硝唑含量的紫外- 可見分光光度法專屬性不強，易受輔料等雜質(zhì)干擾；測定膽紅素含量的高效液相色譜（HPLC）法，流動相和提取溶劑均用到了三氯甲烷，其對人體有害，且易揮發(fā)，在光照條件下易氧化，分解為劇毒的碳酰氫和氯化氫，作為溶劑對液相流路部分有侵蝕效應［6］。鑒于此，本研究中建立了同時測定人工牛黃甲硝唑膠囊中膽紅素和甲硝唑含量的HPLC法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；SK8200HP 型超聲波清洗機（上?？茖С晝x器有限公司）；XS205 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；CLXXXUVM2 型純水機（瑞士Elga公司）。

1.2 試藥

人工牛黃甲硝唑膠囊（企業(yè)A 1批，批號為201101；企業(yè)B3批，批號分別為366201191，366210503，366201061；規(guī)格均為每粒含甲硝唑200 mg、人工牛黃5 mg）；甲硝唑?qū)φ掌罚ㄅ枮?00191 - 201808，含量100.0%），膽紅素對照品（批號為100077-202009，含量98.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：1%醋酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～6.0 min 時92%A，6.0～6.1 min 時92%A →2%A，6.1～16.0 min 時2%A，16.0～16.1 min 時2%A →92%A，16.1～22.0 min 時92%A）；流速：1 mL/ min；檢測波長：320 nm（甲硝唑）、449 nm（膽紅素）；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL（甲硝唑）、5μL（膽紅素）。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取膽紅素對照品適量，精密稱定，加二氯甲烷制成含膽紅素8 μg/mL 的對照品溶液Ⅰ；取甲硝唑?qū)φ掌愤m量，105 ℃干燥2 h，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成含甲硝唑0.1 mg/mL的對照品溶液Ⅱ。

供試品溶液：取樣品適量（約10 粒，相當于人工牛黃50 mg），精密稱定，置50 mL 棕色容量瓶中，加提取溶劑［二氯甲烷- 甲醇- 水- 鹽酸（90∶10∶0.3∶0.03，V/V/V/V）］30 mL，冰浴超聲（功率500 W，頻率53 kHz）20 min 使溶解，用提取溶劑定容，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液Ⅰ。取樣品適量（約1 粒，相當于甲硝唑200 mg），精密稱定，置200 mL容量瓶中，加50%甲醇振搖使溶解并定容，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液Ⅱ。

陰性對照品溶液：按人工牛黃甲硝唑膠囊的處方及工藝分別制備缺人工牛黃或甲硝唑的單一陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液Ⅰ和Ⅱ。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性及專屬性試驗：取2.2 項下6 種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖相應位置處有吸收峰。理論板數(shù)按膽紅素、甲硝唑峰計均不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

1.膽紅素 2.甲硝唑A1.對照品溶液Ⅰ B1.供試品溶液Ⅰ C1.陰性對照品溶液Ⅰ A2.對照品溶液Ⅱ B2.供試品溶液Ⅱ C2.陰性對照品溶液Ⅱ圖1 高效液相色譜圖1.Bilirubin 2.MetronidazoleA1.Reference solution Ⅰ B1.Test solution Ⅰ C1.Negative reference solution Ⅰ A2.Reference solution Ⅱ B2.Test solution ⅡC2.Negative reference solution ⅡFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：取膽紅素對照品約10 mg，置100 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，制成含膽紅素98.90 μg/ mL 的對照品貯備液Ⅰ，分別量取適量，稀釋，制成含膽紅素1.98，3.96，5.93，7.91，9.89，11.87，13.85μg/mL的系列對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以膽紅素質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y1=25 474X1+7 329（r=0.999 9，n=7）。結果表明，膽紅素質(zhì)量濃度在1.98～13.85μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。取甲硝唑?qū)φ掌愤m量，105 ℃干燥2 h，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成含甲硝唑1 006.4μg/mL的對照品貯備液Ⅱ，分別量取適量，稀釋，制成含甲硝 唑20.13，50.32，80.51，100.64，120.77，150.96，201.28μg/mL的系列對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以甲硝唑質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y2= 23 902X2- 59 310（r= 0.999 9，n= 7）。結果表明，甲硝唑質(zhì)量濃度在20.13～201.28 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

定量限考察：取線性關系考察項下對照品貯備液Ⅰ適量，加二氯甲烷稀釋，制成含膽紅素0.098 9μg/mL的溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，得膽紅素峰的信噪比為9.4，按信噪比10∶1 計算，膽紅素定量限為0.10 μg/ mL。取對照品貯備液Ⅱ適量，加50%甲醇稀釋，制成含甲硝唑0.040 3 μg/ mL 的溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，得甲硝唑峰的信噪比為7.1，按信噪比10∶1計算，甲硝唑定量限為0.057μg/mL。

精密度試驗：取2.2 項下供試品溶液Ⅰ和Ⅱ各適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，計算峰面積。結果膽紅素和甲硝唑峰面積的RSD分別為0.42%和0.21%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液Ⅰ和Ⅱ各適量，分別在室溫下放置0，4，12，16，18，24 h及0，4，8，12，24，36，48 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果表明，供試品溶液Ⅰ峰面積的RSD為0.82%（n=6），表明其室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；供試品溶液Ⅱ峰面積的RSD為0.40%（n=7），表明其室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為201101）內(nèi)容物適量，各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果膽紅素、甲硝唑平均含量分別為0.032 mg/ 粒和101.42%，RSD分別為1.00%和0.31%（n=6）。

加樣回收試驗：取樣品（批號為201101）內(nèi)容物適量，各9 份，精密加入膽紅素對照品及甲硝唑?qū)φ掌愤m量，按2.2項下方法分別制備膽紅素及甲硝唑的供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取B 企業(yè)3 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再分別按2.1項下色譜條件及法定方法進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=3）Tab.2 Results of content determination of bilirubin and metronidazole in samples（n=3）

3 討論

3.1 流動相選擇

目前，現(xiàn)行標準和文獻中規(guī)定膽紅素的流動相中均含有三氯甲烷［7-8］，且僅針對膽紅素的檢測。三氯甲烷為易制毒物且對環(huán)境污染大，故本研究中對流動相進行優(yōu)化，采用對環(huán)境傷害較小的1%醋酸水溶液-乙腈（5∶95，V/V）代替原有含三氯甲烷的流動相，同時兼顧了甲硝唑的檢測。經(jīng)反復試驗，本研究中最終在該流動相基礎上采用梯度洗脫，2個組分均在合理的時間范圍內(nèi)洗脫。

3.2 波長和溶劑選擇

由于甲硝唑和膽紅素最大吸收波長相差較大，故采取雙波長檢測。結合甲硝唑和膽紅素掃描圖譜和現(xiàn)行標準，確定甲硝唑檢測波長為320 nm，膽紅素檢測波長為449 nm。參考2020 年版《中國藥典》中甲硝唑膠囊的現(xiàn)行標準，甲硝唑提取溶劑采用50%甲醇。結合型膽紅素由膽紅素蛋白和鈣元素聚合而成，難溶于水和有機溶劑［9-10］。游離膽紅素的分子結構為折疊型，故易在二氯甲烷、苯、三氯甲烷等有機溶劑中溶解，為了將結合型膽紅素解離轉(zhuǎn)化為游離膽紅素，多用酸作為解離劑［11-12］。故膽紅素多用三氯甲烷和酸組合來提取。據(jù)報道，在提取溶劑中加入甲醇對樣品的滲透性較好，且能提高提取效率［13-14］。因二氯甲烷毒性低于三氯甲烷，預試驗中考察了不同比例二氯甲烷和甲醇的提取效率及參考現(xiàn)行標準，確定了二氯甲烷- 甲醇- 水-鹽酸（90∶10∶0.3∶0.03，V/V/V/V）為提取溶劑。

3.3 進樣量選擇

預試驗中在進樣量為10μL 時，膽紅素濃度較高時峰形欠佳，柱效過低，當進樣量≤5 μL 時峰形良好。另外，不同來源的人工牛黃中膽紅素含量差異較大，為適應檢測需求，將進樣量設為5μL。

3.4 方法評價

本研究中建立了可同時測定人工牛黃甲硝唑膠囊中甲硝唑和膽紅素含量的HPLC 法。該方法與制劑法定標準檢測結果相近，且改進了甲硝唑的檢測方法，優(yōu)化了膽紅素的提取溶劑。所建立的方法準確度高、重復性好，可用于本品中2 個有效成分的同時測定與質(zhì)量控制，也為其他含牛黃制劑的測定提供了參考。