基于網絡藥理學和實驗驗證研究高良姜素乳膏抗白癜風的作用機制

祖力皮卡爾·吾斯曼 張數數 閆 明 李治建 霍仕霞

1.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區維吾爾藥物研究所，新疆烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院，新疆烏魯木齊 830049

白癜風是一種常見的黑素細胞缺失導致皮膚出現色素脫失斑的色素障礙性皮膚病，患病率為0.5%～2.0%，其病因尚未確定[1]。目前臨床上治療白癜風的方法有手術、光療[2]、外用激素[3]、口服免疫抑制劑[4]及抗氧化劑[5]等，雖然有一定的效果，但也有一定的副作用。高良姜素（Galangin，GA）是從高良姜的根部提取的一種天然黃酮（3，5，7-三羥基黃酮），具有抗腫瘤[6]、抗氧化[7]和抗感染[8]活性。本課題組前期研究發現，GA具有促進黑色素合成的作用[9]。本研究運用網絡藥理學[10-11]及分子對接等分析方法，對GA 乳膏抗白癜風作用機制進行研究，以期為白癜風治療藥物的開發及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 作用靶點的篩選 運用Swiss Target Prediction 數據庫，獲取其吸收、分布、代謝、排泄和毒性水平，并結合中藥系統藥理學數據庫與分析平臺的中藥動學參數篩選標準對GA 靶點進行篩選。

1.1.2 構建白癜風疾病靶點數據庫 利用TTD、OMIM、DrugBank 數據庫，以“vitiligo”為關鍵詞，檢索與白癜風相關的基因，構建白癜風疾病靶點數據庫。

1.1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建 用R 語言進行維恩圖映射交集處理藥物和疾病靶點，將藥物和疾病靶點輸入String平臺（https://cn.string-db.org/），通過Cytoscape 3.7.1 尋找核心靶點，構建藥物-疾病靶點PPI 網絡。

1.1.4 基因富集分析 為了闡明GA 治療白癜風的作用，將得到的核心靶標進行GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析。

1.1.5 分子對接 借助ZINC 數據庫（http://zinc.docking.org/）下載GA 的3D 結構，作為對接配體。采用Auto Tools 對核心靶點晶體結構蛋白進行預處理，作為分子對接的受體。以配體和受體使用Autodock Vina 1.2進行對接，最后取優勢構象進行分析，對接結果中Vina 分值≤-4.5，說明關鍵靶點與化合物的結合能力較好[12]。

1.2 動物實驗材料

1.2.1 實驗動物 選取60 只4 周齡SPF 級雄性C57 BL/6 小鼠，體重（21±3）g，購自湖南精達實驗動物有限公司。實驗動物生產許可證編號：SCXK（湘）2019-0004。本實驗經新疆醫科大學動物倫理委員會批準（IACUC-20211118-03），動物接收后飼養在屏障系統內，適應性喂養1 周，每籠5 只，自由進食、進水。

1.2.2 主要試劑與儀器1%GA 乳膏（20190910），規格為20 g/支，淡黃色膏體，由新疆維吾爾自治區維吾爾藥物研究所提供。1%8-甲氧補骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP）（重慶華邦制藥股份有限公司，M861678）；10%H2O2溶液（河南標準物質研發中心，MY15480）。酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自上海酶聯生物技術有限公司，包括內皮素-1（endothelin-1，ET-1）（210620），白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）（210715），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（210723）。BCA 蛋白定量試劑盒（WB0028）、TBST（WB0043）均購自天德瑞生物科技有限公司。Trizol（美國Thermo，15596026）；ET-1 一抗（美國Abcam，ab2786）；TNF-α一抗（北京博奧森生物技術有限公司，bs-2081）；二抗HPR goat anti-mouse IgG（美國Sigma，SA00001-1）；mRNA 逆轉錄試劑盒（北京康為世紀有限公司，CW 2569）。引物均由上海生工公司合成。ET-1 引物序列：正向引物為5’-GAAGTTGACGCACAACCGAG-3’，反向引物為5’-CTCTGCCCGTCTGAACAAGA-3’；IL-18引物序列：正向引物為5’-TCAGCTGGGAAAACTCAGGA-3’，反向引物為5’-AGCTAATGTGACGCACTGGG-3’；TNF-α 引物序列：正向引物為5’-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3’，反向引物為5’-CACCCCGAAGTTCAGTAGACA-3’。實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo，PIKOREAL96）；臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，L-420）。

1.2.3 藥物的制備 制備低（1%）、中（2%）、高（4%）劑量GA 乳膏，在原有乳膏的基礎上提高GA 含量，稱取各輔料，將所需的油相及水相分別放入不同的燒杯，在85℃的水浴中融化并均勻化。將油相慢慢倒入水相中，以600 r/min 的速度攪拌5 min，冷卻至室溫，濃縮后得到不同劑量的GA 乳膏。

1.3 動物實驗方法

1.3.1 動物分組及干預 選取10 只小鼠設為正常對照組，其余50 只將背部2 cm×2 cm 區域剃毛，剃毛1次/3 d。剃毛區域均勻涂抹10%H2O2構建白癜風動物模型[13]，以造模區域毛發顏色變化及皮膚白斑情況確認造模成功[14]。造模成功后按隨機數字表法將其分為模型組、陽性藥組及GA 乳膏低、中、高劑量組，每組10 只。GA 乳膏各劑量組在造模區進行涂抹給藥，1 g/次，1 次/d；陽性藥組灌胃8-MOP4.25 mg/kg，2 次/d，間隔時間為6 h，連續給藥30 d。模型組及正常對照組不進行干預。

1.3.2 血液和皮膚樣本的制備 實驗結束后，采集血樣，靜置1 h 后在4℃的條件下分離血清，用手術刀在小鼠造模區域皮膚進行1.5 cm×1.5 cm 的切取，將皮膚組織樣本部分放在4%多聚甲醛中，部分儲存在-80℃冰箱中。

1.3.3 組織病理學檢查 取小鼠造模部位的皮膚，用石蠟塊包裹，并切成3～5 μm 的切片，用蘇木精-伊紅染色。

1.3.4 血清ET-1、TNF-α 及IL-18 檢測 用酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測血清中的ET-1、TNF-α 及IL-18。

1.3.5 Western blot 分析 使用BCA 蛋白測定試劑盒測定皮膚組織中的蛋白濃度，將組織樣品（50 μg）煮沸5 min，裝入10%的聚丙烯酰胺凝膠，然后轉移到PVDF 膜上。用三緩沖鹽水加TBST 緩沖液和3%的牛血清白蛋白在室溫下將膜封鎖1 h。將膜與一抗（稀釋度1∶500）在4℃下孵育過夜，用TBST（3～5 次）沖洗5 min，然后與二抗（稀釋度1∶1 000）在室溫下孵育1 h，用TBST（3～5 次）沖洗5 min。采用增強型化學發光法檢測印跡，使用圖像分析軟件對照β-actin 蛋白確定蛋白條帶的密度。

1.3.6 RT-qPCR 分析 依試劑盒說明書制備PCR 體系：反轉錄產物2 μl，Primer A（10 μmol/L）1 μl，Primer B（10 μmol/L）1 μl，ddH2O 11 μl，2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μl，共30 μl。將制備完成的PCR 反應管放入實時熒光定量PCR 儀內，在95℃預變性15 s，然后以95℃15 s，60℃30 s，70℃15 s 循環40 次進行PCR 反應，以2-ΔΔCt法計算mRNA 表達量。

1.4 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GA 作用靶點篩選

SwissTargetPrediction 數據庫分別輸入GA 的mol2結構式獲取蛋白作用靶點，經蛋白質數據庫Uniprot校驗后根據z’score＞0 得到最終符合條件的17 個基因靶點：NOS2、ET1、ARNT、PTGS2、DPP6、TNF、BCL2、CDk4、CDk1、CYP1A1、IL18、GSTP1、ARNT、NLRP3、IL1β、Casp1、TYR。

2.2 白癜風候選靶點

以“vitiligo”為關鍵詞，應用數據庫查相關疾病靶點。經整理合并后共得到459 個靶點，映射交集處理結果顯示，獲得GA-白癜風交集靶基因有10 個。見圖1。

圖1 GA-白癜風交集靶基因維恩圖

2.3 PPI 網絡構建

GA 治療白癜風靶點及其功能的PPI 網絡圖共有10 個節點，25 條邊，平均節點自由度為5，酪氨酸酶、NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3、誘導性一氧化氮合酶、TNF、IL-1β、IL-18 等為核心靶點。見圖2。

圖2 GA 治療白癜風靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡

2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路分析

藥物疾病交集核心靶點進行GO 富集分析及KEGG 通路富集分析，前10 的途徑見圖3，對富集得到的通路結果見圖4。結果顯示，GA 中有效成分可能通過核因子κB、NOD 樣受體及HIF-1 通路等發揮治療白癜風的作用。

圖3 GA 治療白癜風核心靶點GO 富集分析

圖4 GA 治療白癜風核心靶點KEGG 通路富集分析

2.5 GA 抗白癜風關鍵靶點分子對接

將篩的3 個關鍵靶點的空間結構與GA 的分子結構進行分子對接，結果顯示，GA 與ET-1、TNF-α 和IL-18的對接結合能分別為-4.6、-8.2 和-7.2 kcal/mol。見圖5。

圖5 GA 與作用于白癜風關鍵靶點的分子對接

2.6 六組皮膚組織染色

正常對照組皮膚無明顯異常。模型組皮膚與正常對照組比較，表皮棘層皺襞變厚，毛囊破損及角質層明顯增生。GA 乳膏各劑量組表皮雖有輕微棘層皺襞，與模型組比較明顯改善。見圖6。

圖6 六組皮膚組織蘇木精-伊紅染色（100×）

2.7 六組血清ET-1、TNF-α 及IL-18 水平比較

模型組血清ET-1、IL-18、TNF-α 水平高于正常對照組，GA 乳膏低、中、高劑量組血清ET-1、IL-18、TNF-α 水平低于模型組（P＜0.05）。見圖7。

圖7 六組血清ET-1、TNF-α 及IL-18 水平比較（n=10）

2.8 六組皮膚組織中ET-1 和TNF-α 蛋白表達比較

模型組皮膚組織中ET-1、TNF-α 蛋白表達高于正常對照組（P＜0.05）。GA 乳膏高劑量組皮膚組織ET-1蛋白表達低于模型組，GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織TNF-α 蛋白表達低于模型組（P＜0.05）。GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織TNF-α 蛋白表達低于GA乳膏低劑量組，GA 乳膏高劑量組皮膚組織ET-1 蛋白表達低于GA 乳膏低劑量組（P＜0.05）。見圖8。

圖8 六組皮膚組織中ET-1 和TNF-α 蛋白表達比較（n=10）

2.9 六組皮膚組織中ET-1、TNF-α 及IL-18 mRNA表達比較

模型組皮膚組織中ET-1、IL-18、TNF-α mRNA表達高于正常對照組，GA 乳膏低、中、高劑量組皮膚組織ET-1、TNF-α mRNA 表達低于模型組，GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織IL-18 mRNA 表達低于模型組和GA 乳膏低劑量組（P＜0.05）。見圖9。

圖9 六組皮膚組織中ET-1、TNF-α 及IL-18 mRNA 表達比較（n=10）

3 討論

白癜風是一種自身免疫介導的炎癥性皮膚病，全身任何部位的皮膚均可發生，但好發于易受摩擦、陽光暴曬的暴露部位及褶皺部位[15-16]。白癜風發病的關鍵是黑素細胞合成黑素功能的減退和缺失[17]。本研究運用網絡藥理學的方法，探討了GA 及其作用靶點的相關性，GA 中存在1 個活性成分與多個核心靶標作用的現象，體現了中藥多成分與多靶標之間共同作用的機制，得出ET-1、TNF-α 及IL-18 是GA 治療白癜風的關鍵靶點。

黑素細胞旁分泌網絡與黑素細胞功能減退密切相關[18]，黑素細胞旁分泌網絡是一個復雜的系統[19]，對其功能具有重要調節作用[20]。ET-1 已被證實在白癜風的發生發展過程中扮演著重要的角色[21]。本研究結果顯示，GA 乳膏治療可顯著降低白癜風模型動物血清和皮膚組織中ET-1 的表達水平。

TNF-α 是一種由活化的單核巨噬細胞釋放的炎癥因子，可對黑素細胞產生細胞毒性作用，進而抑制黑素細胞色素生成[22]。白癜風患者TNF-α 水平高于正常人，TNF-α 高表達可誘導角質形成細胞凋亡，誘發白癜風[23]。本研究結果顯示，GA 乳膏治療可顯著降低白癜風模型動物血清和皮膚組織中TNF-α 蛋白及其mRNA的表達水平，發揮顯著的抗黑素細胞凋亡的作用。

IL-18 水平的升高可促進和誘導γ 干擾素及CD8+T 細胞活性而參與白癜風的炎癥反應及發病過程[24]。ET-1 通過p38 MAPK 通路依賴性機制誘導IL-18 的表達[25]。本研究結果提示，GA 乳膏可顯著降低白癜風模型動物血清IL-18 水平及其mRNA 在皮膚組織中的表達水平。

綜上，本研究基于網絡藥理學，通過關聯網絡構建及分析，初步闡釋了GA 治療白癜風的作用機制。實驗研究結果顯示，GA 乳膏很可能通過增加黑素細胞旁分泌網絡ET-1 及炎癥因子TNF-α、IL-18 表達發揮作用，為后續研究白癜風的作用機制提供了研究基礎。