層粘連蛋白γ1 基因沉默對膀胱癌細胞增殖及細胞周期的影響

李彬琦 李文明

1.河北省邯鄲市中心醫院綜合科，河北邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市中心醫院院前急救，河北邯鄲 056001

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，具有易復發、易轉移的特點[1-2]。膀胱癌患者早期僅出現無痛性血尿，往往不夠重視，延誤病情，導致晚期膀胱癌患者治療效果不夠理想，嚴重影響患者生活質量[3-5]。因此，深入研究膀胱癌發生發展的具體分子機制對進一步提高膀胱癌的早期診斷和治療具有重要的意義[6-8]。層粘連蛋白γ1（recombinant laminin gamma 1，LAMC1）作為細胞外基質的重要調節因子，在細胞的增殖、分化和黏附中發揮著重要的作用[9]。LAMC1 在腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移等惡性生物學行為發揮重要作用[10-12]。但LAMC1 對膀胱癌細胞增殖、細胞周期的影響及其相關機制尚不清楚。本研究以膀胱癌細胞5637 作為研究對象，檢測干擾LAMC1 基因表達后對膀胱癌細胞增殖和細胞周期的影響并探討其潛在的相關機制，旨在探討LAMC1 與膀胱癌細胞生物學特性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究從河北省邯鄲市中心醫院采集了2019 年1 月至2021 年12 月的行根治膀胱全切術并經病理確診的48 例膀胱癌患者的癌及癌旁組織，癌旁組織選擇距癌灶邊緣5 cm 以上并病理診斷為正常組織。其中包括男32 例，女16 例；＜60 歲14 例，≥60 歲34 例；平均年齡（66.3±14.2）歲；T2期26 例，T3～4期22 例。本研究經河北省邯鄲市中心醫院倫理委員會批準通過（20190124），并在采集標本前均獲得患者知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 納入及排除標準

納入標準：①原發性腫瘤，且術后病理組織活檢證實為膀胱癌；②有完整的臨床、病理及預后隨訪資料。排除標準：①妊娠期及哺乳期的婦女；②合并其他惡性腫瘤；③肝、腎功能障礙；④合并自身免疫性疾病、血液系統疾病及其他器官或系統惡性腫瘤；⑤術前行放、化療及免疫治療。

1.3 材料

人膀胱癌UMUC3、T24、5637 及J82 細胞購于中國科學院上海生科院細胞庫；RPMI-1640（SH30809。01）培養基和胎牛血清（貨號：SV30087.03）購于美國Hyclone 公司；LipofectamineTM2000、青霉素/鏈霉素雙抗、SuperScript ⅣFirst-Strand Synthesis System 試劑盒購于美國賽默飛公司；RNA 提取試劑盒（貨號：DP424）購于北京天根生化科技有限公司；二甲基亞砜細胞凍存液（貨號：ST1276）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution,PBS）（貨號：C0221B）、0.25%胰蛋白酶（貨號：C0209）、電轉緩沖液（貨號：P0021A）、電泳緩沖液（貨號：ST466）、吐溫20（貨號：ST2789）、蛋白質裂解緩沖液（貨號：P0013B）、PVDF 膜即聚偏二氟乙烯膜（貨號：FFP19 和FFP24）、BCA 蛋白檢測試劑盒（貨號：P0010S）、電化學發光ECL 試劑盒（貨號：P0018S）及Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（貨號：C0038）購于碧云天生物有限公司；細胞周期試劑盒（貨號：KGA511）凱基生物有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（30～50 gels）（貨號：AR0138）購于武漢博士德生物工程有限公司。LAMC1 干擾質粒及其陰性對照質粒購于上海和元生物技術股份有限公司。兔抗人LAMC1 單克隆抗體（貨號：ab233389）、兔抗人cyclin D1 單克隆抗體（貨號：ab134175）、兔抗人cyclin A 單克隆抗體（貨號：ab181591）、兔抗人p16 單克隆抗體（貨號：ab51243）、兔抗人p21 單克隆抗體（貨號：ab109520）購于Abcam 生物公司。

1.4 研究方法

1.4.1 細胞培養及細胞轉染 人膀胱癌細胞UMUC3、T24、5637 及J82 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基進行培養。選擇處于對數生長期的5637 細胞接種于6 孔板中，設置LAMC1 沉默組和陰性對照組，培養12～24 h 后待細胞融合度至60%時進行細胞轉染，根據Lipofectamine 2000 說明書進行操作轉染。待細胞轉染6～12 h 后更換新鮮培養基，48 h 后收集細胞并提取RNA，采用實時熒光定量PCR 法和Western blot 驗證LAMC1 mRNA 及蛋白表達水平，驗證干擾質粒轉染效果。

1.4.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time quantity polymerase chain reaction，RTqPCR）常規培養細胞，設置LAMC1 沉默組和陰性對照組，使用RNA 提取試劑盒提取5637 細胞中的總RNA；使用SuperScript ⅣFirst-Strand Synthesis System試劑盒逆轉錄cDNA，使用SYBR Green 試劑盒在Bio-Rad IQ5 PCR 系統上進行Rt-qPCR 擴增。反應體系：cDNA 模板1 μl，SYBR Green Mix 10 μl，PCR 正反向引物（20 μmol/L）各1 μl，RNA 無酶水20 μl。PCR擴增條件為：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，循環30次；95 ℃15 s；65℃1 min，以GAPDH 作為內參，用2-ΔΔCt方法計算目的基因LAMC1 mRNA 的相對表達量，RT-qPCR 引物由武漢金斯瑞生物公司合成，引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列

1.4.3 CCK-8 檢測細胞增殖 取處于對數生長期的細胞進行實驗，于96 孔板上接種5637 細胞（每組1×104個/孔），設置LAMC1 沉默組和陰性對照組，每組設置3 個復孔；向每孔加入10 μl CCK-8 溶液并置于恒溫培養箱中孵育，37℃避光孵育2～3 h，使用酶聯免疫檢測儀分別在24、48、72 h 時間點每孔在450 nm波長處的OD 值，繪制細胞生長曲線。

1.4.4 克隆形成試驗 用0.25%胰蛋白酶消化制作出單細胞懸液，使用細胞計數板對其進行計數，將500 個細胞數量/孔種植在6 孔板中，每組設置3 個復孔；2～3 周，每隔4 d 換1 次新的培養基。將6 孔板移出，用4%多聚甲醛固定、1%晶體紫染色、PBS 連續沖洗5～8 次，拍攝照片，計數克隆數目，取平均值。

1.4.5 流式細胞術檢測細胞周期 于6 孔板上接種5637 細胞（每組1×105個/孔），培養24～72 h 后胰酶消化并收集細胞；PBS 洗滌2 次；70%冷乙醇置于冰箱內固定2 h，PBS 洗2 次，加入5 μl RNaseA（濃度為30mg/L）去除RNA 的影響，加入5μl 碘化丙啶（50 mg/L）染液避光孵育30 min；PBS 洗滌2 次，用600 μl PBS重懸細胞，最后流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.4.6 免疫組織化學法 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（streptavidin-perosidase，SP）檢測LAMC1 表達，通過二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、過氧化氫離子水孵育、高溫高壓抗原修復，隨后滴加兔抗人LAMC1 一抗（1∶100）4℃孵育過夜，次日滴加二抗室溫孵育1 h。二氨基二苯胺顯色，蘇木精復染，膠封。陰性對照組則以相同劑量的PBS 替代一抗。在對免疫組織化學染色結果的解讀過程中，由兩名經驗豐富的病理醫生進行雙盲讀片，最后的免疫組織化學得分是以染色的強度及陽性細胞所占的比例這兩項乘積。在顯微鏡下隨機選擇5 個高倍鏡視野（400×），每個視野中計數100 個腫瘤細胞。染色強度評分：未著色為0 分，淡黃色為1 分，黃褐色為2 分，褐色為3分。陽性細胞所占的百分比：無陽性細胞為0 分；1%～25%為1 分；＞25%～50%為2 分；＞50%為3 分。LAMC1 表達強度的總分評判：＞4 分為高表達，≤4 分為低表達。

1.4.7 Western blot 實驗5637 細胞用蛋白質裂解緩沖液溶解，并提取總蛋白質；用BCA 試劑盒檢測蛋白質濃度并進行變性處理。然后將樣品電泳，轉膜，10%的脫脂牛奶密封，加入兔抗人LAMC1 單克隆抗體（1∶5 000）、兔抗人cyclin D1 單克隆抗體（1∶3 000）、兔抗人cyclin A 單克隆抗體（1∶4 000）、兔抗人p16 單克隆抗體（1∶2 000）、兔抗人p21 單克隆抗體（1∶2 000）在4℃下孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。最后用ECL 發光試劑盒顯影。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料采用例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAMC1 mRNA 在膀胱癌細胞中的表達水平

RT-qPCR 檢測結果顯示，5637 細胞中LAMC1 mRNA 表達水平高于UMUC3、T24、J82 細胞（P＜0.05）。因此，本研究中選取表達水平最高的5637 細胞進行后續研究。

2.2 LAMC1 在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達

LAMC1 在癌旁組織中呈現呈淡灰色或無著色，染色強度較淺，而在膀胱癌組織中呈棕色或棕褐色，染色強度較深（圖2）。LAMC1 在膀胱癌組織中陽性表達率為64.58%（31/48），在癌旁組織中陽性表達率為35.41%（55/48），膀胱癌組織與癌旁組織中LAMC1陽性表達率比較，差異無統計學意義（χ2=1.54，P＞0.05）。

圖2 層粘連蛋白γ1 在膀胱癌及癌旁組織中的表達水平

2.3 LAMC1 沉默穩定細胞株的建立

LAMC1 沉默組中的LAMC1 mRNA 和蛋白表達水平低于陰性對照組（P＜0.01）。見圖3。

圖3 RT-qPCR 和Western blot 檢測轉染LAMC1 siRNA 后膀胱癌細胞5637 中LAMC1 的mRNA 和蛋白表達水平（n=3）

2.4 沉默LAMC1 對5637 細胞增殖及克隆形成能力的抑制作用

CCK-8 法檢測結果顯示，LAMC1 沉默組在24、48、72 h 時間點的細胞增殖活力低于陰性對照組（P＜0.01）（圖4A）。此外，細胞克隆形成實驗結果顯示，LAMC1 沉默組5637 細胞集落形成率低于陰性對照組（P＜0.01）（圖4B～C）。

圖4 CCK-8 法及克隆形成實驗觀察LAMC1 基因沉默對5637 細胞的增殖的影響（n=3）

2.5 流式細胞術檢測沉默LAMC1 對膀胱癌細胞周期的影響

采用流式細胞術檢測結果顯示，LAMC1 沉默組中細胞中S 期細胞所占的百分比低于陰性對照組（P＜0.01），G1 期細胞所占的百分比高于陰性對照組（P＜0.01）。見圖5。

圖5 流式細胞術檢測沉默LAMC1 表達對人膀胱癌5637 細胞周期的影響（n=3）

2.6 Western blot 檢測沉默LAMC1 對膀胱癌細胞周期蛋白表達水平的影響

Western blot 檢測結果顯示，LAMC1 沉默組中cyclin D1 和cyclin A 蛋白的表達水平低于陰性對照組（P＜0.01），而p16 和p21 蛋白的表達水平高于陰性對照組（P＜0.01）。見圖6。

圖6 Western blot 檢測干擾LAMC1 表達對膀胱癌5637 細胞周期蛋白表達水平的影響（n=3）

3 討論

LAMC1 作為層粘連蛋白家族中的一員，由α、β和γ 鏈組成的三聚體化合物，是細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）的重要調節因子，調控細胞黏附、遷移、分化及細胞增殖[13]。在腫瘤的發生與發展過程中，LAMC1 在腫瘤中高表達并促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[14-15]。Kashima 等[16]發現高級別子宮內膜癌的LAMC1 轉錄水平明顯高于低級別子宮內膜癌，且LAMC1 的表達與子宮內膜癌FIGO 分期、肌層浸潤、頸/附件受累、血管淋巴結侵犯及淋巴結轉移有顯著相關性。Ke 等[17]通過檢測32 例不同病理亞型的腦膜瘤患者中LAMC1 的表達水平，發現LAMC1 在Ⅲ級腦膜瘤中的表達顯著高于Ⅰ級腦膜瘤（P＜0.05），且LAMC1 的表達升高與腫瘤復發及無瘤生存期縮短呈正相關。提示LAMC1 可作為腦膜瘤復發和患者生存的預測指標，有可能成為治療腦膜瘤的新靶點。Kinoshita 等[18]研究發現，LAMC1 在頭頸部鱗狀細胞癌中高表達，沉默LAMC1 表達可明顯抑制癌細胞的遷移和侵襲能力。Nishikawa 等[19]發現LAMC1 在前列腺癌中高表達，進一步的研究表明，miR-29s 可通過直接靶向LAMC1 從而發揮抑制癌細胞的遷移和侵襲的作用。這些研究均表明，LAMC1 基因在不同腫瘤中的表達及其相關作用可能取決于腫瘤的類型和不同腫瘤細胞的特性[20-21]。雖然有研究報道了多種腫瘤存在LAMC1 表達異常，并初步闡明其在腫瘤中的大致作用；但LAMC1 在膀胱癌中表達如何，以及其在膀胱癌中的作用及其相關機制鮮見相關報道。

本研究免疫組織化學結果表明，LAMC1 在膀胱癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，提示其在膀胱癌中異常高表達，可能在膀胱癌的發生與發展過程中扮演癌基因的促癌作用。為了進一步證實LAMC1 對膀胱癌生物學功能的影響，本研究結果顯示下調LAMC1 的表達明顯抑制了5637 細胞的增殖能力和細胞集落形成能力；提示LAMC1 在膀胱癌中可能發揮促癌作用。

研究報道，正常細胞增殖嚴格有序地進行是通過細胞周期有規律地實現的，而腫瘤細胞的無限制增殖的相關機制與細胞周期的失控密切相關[22]。細胞周期是一個非常復雜的過程，其中由細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶和細胞周期蛋白依賴抑制性蛋白組成的細胞周期蛋白組成調控網絡對細胞周期進程進行嚴格而有序的調控，從而控制細胞增殖進程[23-25]。細胞周期實驗結果顯示LAMC1沉默導致G0/G1期細胞周期阻滯，進而抑制細胞增殖；同時cyclin D1 和cyclin A 的表達明顯下調，而p16 和p21 蛋白的表達水平增加。提示LAMC1 可能通過調控細胞周期相關蛋白的表達，從而促進膀胱癌細胞的快速增殖潛能。

綜上所述，沉默LAMC1 基因表達后能夠明顯抑制膀胱癌5637 細胞的增殖和克隆形成能力，促使其發生G0/G1期細胞周期阻滯；其機制可能是調控細胞周期蛋白的表達引起細胞周期分布的改變而起作用，提示LAMC1 可作為膀胱癌潛在的分子治療靶標。