喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女MTHFR C677T 基因突變、血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平與自然流產(chǎn)的關(guān)系

阿卜杜合力力·阿布都熱西提 阿布力孜·阿卜杜扎依爾 范希翔 布祖熱·艾力

1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，新疆喀什 844000；2.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院網(wǎng)絡(luò)信息中心，新疆喀什 844000；3.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，新疆喀什 844000

自然流產(chǎn)指的是孕婦在不受外界因素干擾情況下，妊娠不足28 周時自然終止妊娠，據(jù)統(tǒng)計初產(chǎn)婦自然流產(chǎn)的發(fā)生率＞10%，與遺傳、環(huán)境、免疫等多種因素有關(guān)[1]。研究表明，自然流產(chǎn)與胎盤內(nèi)血液高凝狀態(tài)、胎盤動脈血栓形成有關(guān)[2]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代謝異常是血液高凝的主要原因，是動靜脈栓塞性疾病發(fā)病的獨立危險因素[3]。Hcy 代謝異常與MTHFR 基因突變引起的葉酸代謝紊亂直接相關(guān)，MTHFR C677T 位點多態(tài)性與妊娠早期自然流產(chǎn)風(fēng)險增加有關(guān)[4-5]。在此基礎(chǔ)上本研究探討MTHFRC677T位點基因多態(tài)性、血清Hcy、葉酸及維生素B12水平與新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女發(fā)生自然流產(chǎn)的關(guān)系，以期為臨床研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月至2021 年6 月新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）生殖醫(yī)學(xué)中心就診的75 例自然流產(chǎn)患者為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床診斷為自然流產(chǎn)；②年齡21～40 歲；③維吾爾族。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并生殖系統(tǒng)畸形、體質(zhì)異常；②合并陰道炎、宮頸炎；③胎齡＜12 周或超聲診斷胚胎停止發(fā)育；④合并血液系統(tǒng)疾病，既往凝血功能障礙治療史；⑤合并惡性腫瘤。另選取同期于我院體檢的75 名健康孕婦為對照組，排除既往自然流產(chǎn)、死產(chǎn)、宮內(nèi)生長發(fā)育受限和早產(chǎn)等。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批，審批號：【2022】倫審研第（39）號。受試者均知情同意并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集受試者年齡、人工流產(chǎn)史、胎次、距上次妊娠時間、孕早期感染、孕期被動吸煙、孕期飲酒及Hcy、葉酸、維生素B12、MTHFR C677T 基因多態(tài)性。

1.2.2 血清Hcy、葉酸及維生素B12檢測 觀察組入組次日晨、對照組體檢當(dāng)日晨采集空腹外周靜脈血3 ml注入干燥試管，待血液凝固后取上層離心（4℃下3 000 r/min 離心15 min、離心半徑為10 cm）后取上層血清，-80℃冰箱保存。日立7600 全自動生化分析儀（日本HITACHI 公司）檢測血清Hcy 水平，i1000 全自動化學(xué)發(fā)光儀（美國雅培公司）檢測葉酸、維生素B12水平。

1.2.3 MTHFR C677T 基因多態(tài)性檢測 觀察組入組次日晨、對照組體檢當(dāng)日晨采集空腹外周靜脈血3 ml注入肝素鈉抗凝管混勻后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＝鈨鲅獦?biāo)本，冰浴裂解后離心（3 000 r/min 離心15 min、離心半徑為10 cm）后取上清液60 μl，采用DNA 分離試劑盒（北京康威世紀(jì)生物技術(shù)有限公司）提取基因組DNA。使用PCR 擴增儀C-1000 進(jìn)行PCR 擴增。應(yīng)用常規(guī)酚和氯仿法制備DNA，具體方法如下：MTHFR C677T 正向引物：5’-CGAGGACCTCCCTCAGATT-3’，反向引物5’-ATCCCTCGCCTTGAACAG-3’，引物長度23 bp。反應(yīng)體系：正反向引物各2 μl，無菌去離子水21 μl，基因組DNA 2 μl。具體反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃30 s、60℃30 s，72℃30 s，35 個循環(huán)；72℃10 min。配置濃度為1%的瓊脂糖凝膠，收集5 μl PCR產(chǎn)物，凝膠電泳，對其結(jié)果進(jìn)行觀察。限制性內(nèi)切酶的消化：酶切緩沖液1.0 μl，PCR 擴增產(chǎn)物5.0 μl 和無菌去離子水3.5 μl，Taql 限制性內(nèi)切酶5 μl，65℃水浴酶裂解7 h，應(yīng)用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染分析基因型。經(jīng)過Taql 限制性內(nèi)切酶酶切后，純合突變型（TT）含有59、75 bp 片段，雜合型（CT）含有59、75、134 bp 片段，野生純合型（CC）僅存在134 bp 片段。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組MTHFRC677T 基因型，血清Hcy、葉酸及維生素B12水平；分析不同MTHFR C677T 基因型血清Hcy、葉酸及維生素B12水平差異，探討影響自然流產(chǎn)的因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗。喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女患自然流產(chǎn)的影響因素采用logistic 回歸分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

觀察組人工流產(chǎn)史、孕早期感染占比及人工流產(chǎn)次數(shù)大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組年齡、胎次、距上次妊娠時間、孕期被動吸煙、孕期飲酒比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 兩組MTHFR C677T 基因型分布比較

C677T 位點MTHFR 基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（χ2=1.065，P=0.532），可進(jìn)行遺傳學(xué)分析。兩組基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組MTHFR C677T 基因型分布比較[例（%）]

2.3 兩組血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較

觀察組血清Hcy 水平高于對照組，葉酸及維生素B12水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較（）

表3 兩組血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較（）

注Hcy：同型半胱氨酸。

2.4 不同MTHFR C677T 基因型患者血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較

不同MTHFR C677T 基因型患者血清Hcy、葉酸及維生素B12水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TT 基因型患者血清Hcy 高于CT、CC 基因型，葉酸及維生素B12水平低于CT 和CC 基因型（P＜0.05）；CT和CC 基因型患者血清Hcy、葉酸及維生素B12水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同MTHFR C677T 基因型血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較（）

表4 不同MTHFR C677T 基因型血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較（）

注 與CC 基因型比較，aP＜0.05；與CT 基因型比較，bP＜0.05。Hcy：同型半胱氨酸。

2.5 喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女患自然流產(chǎn)的影響因素分析

以自然流產(chǎn)為因變量（0=否，1=是），以人工流產(chǎn)史（0=否，1=是）、人工流產(chǎn)次數(shù)、孕早期感染（0=無，1=有）、MTHFR C677T 基因分型（0=CC+CT，1=TT）、Hcy（原值帶入）、葉酸（原值帶入）、維生素B12（原值帶入）為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析，結(jié)果顯示，TT基因型、高Hcy 水平是喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女自然流產(chǎn)的危險因素（OR=2.044、2.010，P＜0.05），高葉酸和維生素B12水平是喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女自然流產(chǎn)的保護(hù)因素（OR=0.587、0.614，P＜0.05）。見表5。

表5 喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女患自然流產(chǎn)的影響因素分析

3 討論

MTHFR 是調(diào)節(jié)半胱氨酸、四氫葉酸代謝的關(guān)鍵酶，在Hcy 甲基化代謝產(chǎn)生半胱氨酸的生化過程中起關(guān)鍵作用[6-8]。位于MTHFR 外顯子4 的C677 C→T 基因位點是常見突變位點，突變后MTHFR 活性降低，導(dǎo)致Hcy 在體內(nèi)累積，引起外周血中Hcy 水平增高。T 基因攜帶者會有不同程度的葉酸水平降低，相對于CC 基因型，CT 和TT 基因型患者機體葉酸降低10%和18%[9]。本研究結(jié)果顯示，兩組基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TT 基因型患者外周血Hcy 水平高于CC、CT 基因型。提示MTHFR基因突變可能導(dǎo)致血清Hcy 水平升高。本研究結(jié)果顯示，TT 基因型是喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女自然流產(chǎn)的危險因素。提示MTHFR 基因突變參與自然流產(chǎn)的機制為：MTHFRC 基因主要與體內(nèi)核酸代謝相關(guān)，MTHFR C677T 位點突變，導(dǎo)致MTHFRC 酶活性會降低，造成5-甲基四氫葉酸合成減少，核酸代謝障礙，胚胎停止發(fā)育或發(fā)育異常[10-12]。

Hcy 是一種中間含巰基的氨基酸，由蛋氨酸衍生而來，Hcy 產(chǎn)生的氧化自由基可引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化降解，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和功能障礙，與動脈粥樣硬化及血栓形成有關(guān)[13-15]。本研究結(jié)果顯示，高水平Hcy 是自然流產(chǎn)的危險因素。提示Hcy 水平過高可能導(dǎo)致流產(chǎn)風(fēng)險增加。既往研究發(fā)現(xiàn)，Hcy 水平升高與出生時胎齡小、先兆子癇、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、低出生體重或?qū)m內(nèi)生長受限等不良妊娠結(jié)局風(fēng)險增加有關(guān)[16]。Hcy 水平＞10 μmol/L 時，宮內(nèi)胎死風(fēng)險增加2 倍，當(dāng)Hcy 水平＞15 μmol/L 時，出現(xiàn)自然流產(chǎn)的風(fēng)險增加7倍[17]。分析原因為Hcy 水平增高通過多種途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加子宮動脈血流阻力，導(dǎo)致子宮動脈損傷、血管栓塞和胎兒營養(yǎng)供應(yīng)異常，繼而影響胚胎發(fā)育，導(dǎo)致自然流產(chǎn)[18]。此外，Hcy 對胎盤細(xì)胞的直接毒性作用可引起胚胎發(fā)育異常，最終導(dǎo)致流產(chǎn)。

維生素B12參與蛋氨酸、胸腺嘧啶的合成，使甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，將甲基轉(zhuǎn)移給甲基受體（如Hcy）使甲基受體成為甲基衍生物，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。此外，維生素B12保護(hù)葉酸在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移和貯存，維生素B12缺乏時可引起葉酸含量降低，造成甲基從Hcy 向甲硫氨酸轉(zhuǎn)移障礙，甲基在細(xì)胞內(nèi)聚集[19]。妊娠期間葉酸和維生素B12對胎兒生長發(fā)育至關(guān)重要，MTHFR 突變孕婦補充葉酸和維生素B12可降低Hcy 水平和妊娠丟失[20]。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清葉酸和維生素B12水平低于對照組，高葉酸和維生素B12是自然流產(chǎn)的保護(hù)性因素。提示增加葉酸和維生素B12水平有助于降低自然流產(chǎn)的風(fēng)險。分析原因為補充葉酸和維生素B12有助于降低Hcy 水平，減弱Hcy水平過高對子宮動脈和胎盤的損傷作用及對胚胎的毒性作用，促使胚胎正常發(fā)育，降低自然流產(chǎn)風(fēng)險。前期研究表明，妊娠期間給予葉酸對改善妊娠結(jié)局和減少妊娠并發(fā)癥有著積極意義[21]。

綜上所述，MTHFR C677T 基因突變、高Hcy 水平是喀什地區(qū)維吾爾族妊娠婦女患自然流產(chǎn)的危險因素，高葉酸和維生素B12水平是保護(hù)因素，補充葉酸和維生素B12可能降低Hcy 水平和自然流產(chǎn)風(fēng)險。本研究創(chuàng)新性在于發(fā)現(xiàn)了自然流產(chǎn)孕婦不同MTHFR C677T基因分型中葉酸和維生素B12水平差異，局限性在于本研究為單中心研究，樣本數(shù)量較少，需要多中心大樣本研究來驗證結(jié)論的可靠性。