喀什地區維吾爾族妊娠婦女MTHFR C677T 基因突變、血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平與自然流產的關系

阿卜杜合力力·阿布都熱西提 阿布力孜·阿卜杜扎依爾 范希翔 布祖熱·艾力

1.新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院藥學部，新疆喀什 844000；2.新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院網絡信息中心，新疆喀什 844000；3.新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院醫務部，新疆喀什 844000

自然流產指的是孕婦在不受外界因素干擾情況下，妊娠不足28 周時自然終止妊娠，據統計初產婦自然流產的發生率＞10%，與遺傳、環境、免疫等多種因素有關[1]。研究表明，自然流產與胎盤內血液高凝狀態、胎盤動脈血栓形成有關[2]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代謝異常是血液高凝的主要原因，是動靜脈栓塞性疾病發病的獨立危險因素[3]。Hcy 代謝異常與MTHFR 基因突變引起的葉酸代謝紊亂直接相關，MTHFR C677T 位點多態性與妊娠早期自然流產風險增加有關[4-5]。在此基礎上本研究探討MTHFRC677T位點基因多態性、血清Hcy、葉酸及維生素B12水平與新疆維吾爾自治區喀什地區維吾爾族妊娠婦女發生自然流產的關系，以期為臨床研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月至2021 年6 月新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院（以下簡稱“我院”）生殖醫學中心就診的75 例自然流產患者為觀察組，納入標準：①經臨床診斷為自然流產；②年齡21～40 歲；③維吾爾族。排除標準：①合并生殖系統畸形、體質異常；②合并陰道炎、宮頸炎；③胎齡＜12 周或超聲診斷胚胎停止發育；④合并血液系統疾病，既往凝血功能障礙治療史；⑤合并惡性腫瘤。另選取同期于我院體檢的75 名健康孕婦為對照組，排除既往自然流產、死產、宮內生長發育受限和早產等。本研究經我院倫理委員會審批，審批號：【2022】倫審研第（39）號。受試者均知情同意并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集受試者年齡、人工流產史、胎次、距上次妊娠時間、孕早期感染、孕期被動吸煙、孕期飲酒及Hcy、葉酸、維生素B12、MTHFR C677T 基因多態性。

1.2.2 血清Hcy、葉酸及維生素B12檢測 觀察組入組次日晨、對照組體檢當日晨采集空腹外周靜脈血3 ml注入干燥試管，待血液凝固后取上層離心（4℃下3 000 r/min 離心15 min、離心半徑為10 cm）后取上層血清，-80℃冰箱保存。日立7600 全自動生化分析儀（日本HITACHI 公司）檢測血清Hcy 水平，i1000 全自動化學發光儀（美國雅培公司）檢測葉酸、維生素B12水平。

1.2.3 MTHFR C677T 基因多態性檢測 觀察組入組次日晨、對照組體檢當日晨采集空腹外周靜脈血3 ml注入肝素鈉抗凝管混勻后放入-80℃冰箱保存備用。解凍血標本，冰浴裂解后離心（3 000 r/min 離心15 min、離心半徑為10 cm）后取上清液60 μl，采用DNA 分離試劑盒（北京康威世紀生物技術有限公司）提取基因組DNA。使用PCR 擴增儀C-1000 進行PCR 擴增。應用常規酚和氯仿法制備DNA，具體方法如下：MTHFR C677T 正向引物：5’-CGAGGACCTCCCTCAGATT-3’，反向引物5’-ATCCCTCGCCTTGAACAG-3’，引物長度23 bp。反應體系：正反向引物各2 μl，無菌去離子水21 μl，基因組DNA 2 μl。具體反應條件為：94℃3 min；94℃30 s、60℃30 s，72℃30 s，35 個循環；72℃10 min。配置濃度為1%的瓊脂糖凝膠，收集5 μl PCR產物，凝膠電泳，對其結果進行觀察。限制性內切酶的消化：酶切緩沖液1.0 μl，PCR 擴增產物5.0 μl 和無菌去離子水3.5 μl，Taql 限制性內切酶5 μl，65℃水浴酶裂解7 h，應用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染分析基因型。經過Taql 限制性內切酶酶切后，純合突變型（TT）含有59、75 bp 片段，雜合型（CT）含有59、75、134 bp 片段，野生純合型（CC）僅存在134 bp 片段。

1.3 觀察指標

比較兩組MTHFRC677T 基因型，血清Hcy、葉酸及維生素B12水平；分析不同MTHFR C677T 基因型血清Hcy、葉酸及維生素B12水平差異，探討影響自然流產的因素。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。計數資料用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗。喀什地區維吾爾族妊娠婦女患自然流產的影響因素采用logistic 回歸分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較

觀察組人工流產史、孕早期感染占比及人工流產次數大于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組年齡、胎次、距上次妊娠時間、孕期被動吸煙、孕期飲酒比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 兩組MTHFR C677T 基因型分布比較

C677T 位點MTHFR 基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（χ2=1.065，P=0.532），可進行遺傳學分析。兩組基因型、等位基因分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組MTHFR C677T 基因型分布比較[例（%）]

2.3 兩組血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較

觀察組血清Hcy 水平高于對照組，葉酸及維生素B12水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較（）

表3 兩組血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較（）

注Hcy：同型半胱氨酸。

2.4 不同MTHFR C677T 基因型患者血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較

不同MTHFR C677T 基因型患者血清Hcy、葉酸及維生素B12水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。TT 基因型患者血清Hcy 高于CT、CC 基因型，葉酸及維生素B12水平低于CT 和CC 基因型（P＜0.05）；CT和CC 基因型患者血清Hcy、葉酸及維生素B12水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同MTHFR C677T 基因型血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較（）

表4 不同MTHFR C677T 基因型血清Hcy、葉酸及維生素B12 水平比較（）

注 與CC 基因型比較，aP＜0.05；與CT 基因型比較，bP＜0.05。Hcy：同型半胱氨酸。

2.5 喀什地區維吾爾族妊娠婦女患自然流產的影響因素分析

以自然流產為因變量（0=否，1=是），以人工流產史（0=否，1=是）、人工流產次數、孕早期感染（0=無，1=有）、MTHFR C677T 基因分型（0=CC+CT，1=TT）、Hcy（原值帶入）、葉酸（原值帶入）、維生素B12（原值帶入）為自變量進行logistic 回歸分析，結果顯示，TT基因型、高Hcy 水平是喀什地區維吾爾族妊娠婦女自然流產的危險因素（OR=2.044、2.010，P＜0.05），高葉酸和維生素B12水平是喀什地區維吾爾族妊娠婦女自然流產的保護因素（OR=0.587、0.614，P＜0.05）。見表5。

表5 喀什地區維吾爾族妊娠婦女患自然流產的影響因素分析

3 討論

MTHFR 是調節半胱氨酸、四氫葉酸代謝的關鍵酶，在Hcy 甲基化代謝產生半胱氨酸的生化過程中起關鍵作用[6-8]。位于MTHFR 外顯子4 的C677 C→T 基因位點是常見突變位點，突變后MTHFR 活性降低，導致Hcy 在體內累積，引起外周血中Hcy 水平增高。T 基因攜帶者會有不同程度的葉酸水平降低，相對于CC 基因型，CT 和TT 基因型患者機體葉酸降低10%和18%[9]。本研究結果顯示，兩組基因型、等位基因分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；TT 基因型患者外周血Hcy 水平高于CC、CT 基因型。提示MTHFR基因突變可能導致血清Hcy 水平升高。本研究結果顯示，TT 基因型是喀什地區維吾爾族妊娠婦女自然流產的危險因素。提示MTHFR 基因突變參與自然流產的機制為：MTHFRC 基因主要與體內核酸代謝相關，MTHFR C677T 位點突變，導致MTHFRC 酶活性會降低，造成5-甲基四氫葉酸合成減少，核酸代謝障礙，胚胎停止發育或發育異常[10-12]。

Hcy 是一種中間含巰基的氨基酸，由蛋氨酸衍生而來，Hcy 產生的氧化自由基可引發內皮細胞膜脂質的氧化降解，導致血管內皮損傷和功能障礙，與動脈粥樣硬化及血栓形成有關[13-15]。本研究結果顯示，高水平Hcy 是自然流產的危險因素。提示Hcy 水平過高可能導致流產風險增加。既往研究發現，Hcy 水平升高與出生時胎齡小、先兆子癇、復發性流產、低出生體重或宮內生長受限等不良妊娠結局風險增加有關[16]。Hcy 水平＞10 μmol/L 時，宮內胎死風險增加2 倍，當Hcy 水平＞15 μmol/L 時，出現自然流產的風險增加7倍[17]。分析原因為Hcy 水平增高通過多種途徑誘導內皮細胞損傷，增加子宮動脈血流阻力，導致子宮動脈損傷、血管栓塞和胎兒營養供應異常，繼而影響胚胎發育，導致自然流產[18]。此外，Hcy 對胎盤細胞的直接毒性作用可引起胚胎發育異常，最終導致流產。

維生素B12參與蛋氨酸、胸腺嘧啶的合成，使甲基四氫葉酸轉變為四氫葉酸，將甲基轉移給甲基受體（如Hcy）使甲基受體成為甲基衍生物，促進蛋白質合成。此外，維生素B12保護葉酸在細胞內的轉移和貯存，維生素B12缺乏時可引起葉酸含量降低，造成甲基從Hcy 向甲硫氨酸轉移障礙，甲基在細胞內聚集[19]。妊娠期間葉酸和維生素B12對胎兒生長發育至關重要，MTHFR 突變孕婦補充葉酸和維生素B12可降低Hcy 水平和妊娠丟失[20]。本研究結果顯示，觀察組血清葉酸和維生素B12水平低于對照組，高葉酸和維生素B12是自然流產的保護性因素。提示增加葉酸和維生素B12水平有助于降低自然流產的風險。分析原因為補充葉酸和維生素B12有助于降低Hcy 水平，減弱Hcy水平過高對子宮動脈和胎盤的損傷作用及對胚胎的毒性作用，促使胚胎正常發育，降低自然流產風險。前期研究表明，妊娠期間給予葉酸對改善妊娠結局和減少妊娠并發癥有著積極意義[21]。

綜上所述，MTHFR C677T 基因突變、高Hcy 水平是喀什地區維吾爾族妊娠婦女患自然流產的危險因素，高葉酸和維生素B12水平是保護因素，補充葉酸和維生素B12可能降低Hcy 水平和自然流產風險。本研究創新性在于發現了自然流產孕婦不同MTHFR C677T基因分型中葉酸和維生素B12水平差異，局限性在于本研究為單中心研究，樣本數量較少，需要多中心大樣本研究來驗證結論的可靠性。