宏基因組二代測序對下呼吸道感染診斷治療的價值研究

劉莉瓊 劉露 黃暉 徐艷 萬敏娜

（江西省宜春市人民醫院1.呼吸內科；2.全科醫學科，宜春 336000）

呼吸系統感染是臨床常見疾病，實驗室檢測對呼吸系統感染性疾病的及時診斷和治療方案的完善有著重要意義[1]。傳統檢測方法存在敏感性低、特異性差等方面的不足，而且對于罕見病原微生物等不能夠快速識別，影響診斷結果，延誤臨床治療[2]。隨著研究進展，宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）應用于疾病的診斷，能夠更為快速、準確得對下呼吸道感染進行診斷，便于臨床及時進行目標抗感染治療[3]。本院開展了這方面的研究，效果較好。匯報如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

招募2019年11月至2022年11月江西省宜春市人民醫院接診的100例疑似下呼吸道感染患者。納入標準：①有疑似下呼吸道感染相關癥狀；②同意行纖維支氣管鏡檢查及肺泡灌洗并將支氣管肺泡灌洗液（bronchocalveolar lavage fluid，BALF）進行mNGS檢測；③均簽署知情同意協議書。將患者按隨機數字表法進行分組，每組50例。A組男女34∶16，年齡為20~78歲，平均（51.24±7.58）歲；B組男女33∶17，年齡為21~78歲，平均（52.16±7.96）歲。兩組上述基本資料差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。排除：①有精神疾病或認知交流障礙者；②無配對的傳統培養者；③不能耐受纖維支氣管鏡檢查者；④mNGS樣本未通過質量控制者；⑤重要數據遺失者。剔除：①病例納入后，因各種原因各個環節，發現不符合入選標準者；②患者依從性差，特殊生理變化，不適宜繼續接受隨訪觀察者。

1.2 方法

A組接受mNGS及常規培養、細菌、真菌涂片或PCR等傳統檢測。B組接受常規培養、細菌、真菌涂片或PCR等傳統檢測。患者入院后根據病情予抗感染、營養支持等對癥治療，根據檢測結果及時調整治療方案。

BALF的收集根據支氣管肺泡灌洗術操作規范進行[4]。合格的BALF根據《宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識》[5]行mNGS檢測：①樣本滅活處理后提取核酸；②通過DNA片段化、修復末端、測序接頭連接以及PCR擴增等步驟制備文庫，然后上機進行高通量測序；③對數據進行質量控制[讀長50 bp以上檢出序列數（reads）及20 M以上測序數據量]及數據過濾（去除宿主人源序列），與美國國立生物技術信息中心（NCBI）的微生物數據庫進行比對分析；④報告應包括檢測出的所有病原微生物（10 bp以上的匹配獨特讀長及＞1%的數據庫總數比例）及其分類、檢測內容、檢測方法、檢測結果說明及附錄；⑤臨床醫生通過綜合檢測結果及臨床特征，并結合《下呼吸道感染宏基因組二代測序報告臨床解讀路徑專家共識》[6]進行判斷。

1.3 觀察指標

①比較兩組檢測耗時，并以臨床最終診斷為金標準，比較兩組對下呼吸道感染的診斷價值（靈敏度、特異度、準確度）。②每日1次，持續評定或檢測患者急性生理與慢性健康評分Ⅱ（acute physiology and chronic health e-valuationⅡ，APACHE Ⅱ）[7]、白細胞（white blood cell，WBC）、降鈣素原（proealcitonin，PCT）及C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平。③根據衛生部《抗菌藥物臨床研究指導原則》[8]評價臨床療效。痊愈：臨床癥狀、體征、實驗室檢查及細菌學檢查指標均恢復正常；顯效：病情明顯好轉，但上述四項中1項未完全恢復；有效：病情有一定好轉，上述四項中2項或2項以上未完全恢復；無效：病情無好轉或加重，甚至死亡。總有效率=（痊愈例數+顯效例數+有效例數）÷總例數×100%。④觀察兩組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時間。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件，計量資料以均數土標準差（±s）表示，計量資料符合正態分布比較采用兩個獨立樣本t檢驗，符合偏態分布比較采用秩和檢驗；計數資料以例數或率表示，根據樣本條件分別采用χ2檢驗、McNemar檢驗或Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組檢測耗時及診斷價值比較

A組經臨床最終診斷確診43例為下呼吸道感染；B組經臨床最終診斷確診41例為下呼吸道感染。A組檢測耗時短于B組（P＜0.05），對下呼吸道感染診斷的靈敏度、特異度及準確度均高于B組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組檢測耗時及診斷價值比較

2.2 兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平比較

治療前，兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后，兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平均低于治療前，且A組低于B組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平比較（±s）

表2 兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平比較（±s）

分組APACHE II評分/分WBC/（×109/L）PCT/（ng/mL）CRP/（mg/L）治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后A組（n=43）21.14±3.4810.24±1.4620.22±2.318.18±1.040.87±0.090.39±0.074.78±0.981.77±0.26 B組（n=41）21.23±3.5715.77±2.4820.33±3.1414.27±1.380.89±0.110.61±0.094.81±1.212.59±0.32 t值0.17024.8370.31238.3991.45720.6090.20120.681 P值＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05

2.3 兩組療效比較

A組治療總有效率為100.00%，高于B組的85.37%（P＜0.05），見表3。

表3 兩組療效比較[n（%）]

2.4 兩組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時間比較

A組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時間均早于B組（P＜0.05），見表4。

表4 兩組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時間比較（±s，d）

表4 兩組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時間比較（±s，d）

分組體溫改善時間啰音改善時間CRP改善時間WBC改善時間胸片檢查改善時間A組（n=43）1.98±0.642.87±0.773.02±0.753.11±0.814.22±0.94 B組（n=41）2.87±0.974.02±0.944.88±0.875.12±0.926.12±1.03 t值9.1199.79416.26216.27213.254 P值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

3 討論

下呼吸道感染是常見的呼吸系統疾病，包括急性氣管-支氣管炎、肺炎、慢性支氣管炎急性加重、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支氣管擴張等多種類型[9]。臨床上以發熱、咳嗽、咳痰等為主要癥狀，嚴重者可出現氣短、胸悶、呼吸衰竭甚至死亡。下呼吸道感染可由多重病原體引起，主要包括細菌、病毒、真菌、肺炎支原體、衣原體等多種病原微生物，特別是在免疫力低下的人群中，容易并發多重病原體感染[10-11]。因此，快速微生物學診斷對于提高肺部感染的治愈率、降低死亡率顯得尤為重要。但目前的檢測方法只能識別出30%~40%肺部感染性疾病患者的病原體[12]。病原體確診的延遲通常會迫使醫生開出經驗性的廣譜抗生素處方，大大增加抗生素的濫用以及多重耐藥菌的風險，并可能增加嚴重感染患者的死亡率。

由于抗生素的不合理使用等因素，病原微生物種類呈多樣化、復雜化，下呼吸道感染性疾病的診療難度越來越大，這對臨床上病原微生物的診斷方法提出了更高的要求和挑戰[13]。傳統的病原體檢測技術主要是基于病原微生物培養和分離，方法包括傳統微生物培養技術、免疫學方法、PCR等，在病原體檢驗及鑒定中具有不可替代的地位。但傳統病原體檢測受多種因素影響，有陽性率低、耗時長、對檢測人員水平要求高等缺陷，且預防性或經驗性抗生素的使用可能會阻礙實驗室培養結果，生長緩慢的病原體也在一定程度上限制了實驗室培養的敏感性[14]。因此，目前迫切需要一種更靈敏、準確的微生物診斷方法來彌補傳統實驗室檢測方式的缺陷。

mNGS作為一種新型DNA/RNA測序方法，其核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端標記來確定DNA序列，可以同時測定幾百萬甚至上億條DNA或者RNA序列[15-16]。mNGS以其高通量、短耗時、無偏倚的特點在臨床工作中已逐漸得到認可，它不僅可用于多種病原體的檢測，也可用于多種標本的檢測，如痰液、血液、腦脊液、肺泡灌洗液、組織等[17-18]。本研究結果顯示，A組檢測耗時短于B組（P＜0.05）。A組對下呼吸道感染診斷的靈敏度、特異度及準確度均高于B組（P＜0.05），說明mNGS對于下呼吸道感染的病原學診斷價值更高。A組治療后APACHE Ⅱ評分、WBC等感染指標均低于B組（P＜0.05），體溫等癥狀改善時間均早于B組（P＜0.05），治療總有效率高于B組（P＜0.05），提示患者經積極診斷，能更及時改善診療方案，使得患者獲得更為專業的治療，預后得到明顯提高。mNGS檢測方法雖好，但依然存在一定的漏診率。其原因可能受數據庫完整性的影響，或者缺少基因數據庫，使得診斷效果受到影響。而且樣本前處理存在的污染可能也會影響結果。RNA的易降解性也使得檢測難度增加。還需進一步提高mNGS的檢測設備、技術等，以提高診斷準確性，更好地輔助臨床診治。

總之，mNGS對下呼吸道感染診斷的價值較好，可以輔助臨床診治，值得臨床推薦。