漢防己甲素干預(yù)HIF-1α/PD-1/PD-L1 軸抑制口腔鱗癌侵襲潛能的機(jī)制研究

彭坷平，田桂湘*，彭書旺，賓東華，左巧娟，譚 焱，謝海清

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 湖南 長沙410007；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙410011

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是一種口腔惡性腫瘤，因其在口腔惡性腫瘤中的發(fā)病率高達(dá)90%，且具較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[1]。 目前，針對(duì)OSCC 的治療手段主要包括手術(shù)切除、放射治療和化學(xué)藥物治療等，可以有效除去病灶，殺滅體內(nèi)的癌細(xì)胞，改善術(shù)后生存質(zhì)量和延長生存期。 但由于OSCC 靠近上呼吸道和顱腦等關(guān)鍵部位，常規(guī)手術(shù)治療無法徹底清除中晚期已轉(zhuǎn)移的癌組織；同時(shí)，放射治療和化學(xué)藥物治療對(duì)患者的不良反應(yīng)較大，難以滿足患者的需求。因此，針對(duì)OSCC 探索新的療法對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。在臨床應(yīng)用中，與不良反應(yīng)明顯的化學(xué)藥物治療相比，中藥具有藥性溫和、毒性低的優(yōu)勢[2]。漢防己甲素（tetrandrine, TET）是從漢防己根中分離出來的一種生物堿， 具有良好的鎮(zhèn)痛作用，常用于治療硅沉著病（矽肺）、心腦血管以及免疫性疾病[3]。 近年來，TET 的抗腫瘤作用得到了廣泛的研究。 如LUAN 等[4]研究報(bào)道，TET 可以在肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等多種癌癥中發(fā)揮抗癌活性。 然而，關(guān)于TET 對(duì)OSCC 的治療作用及其機(jī)制尚無定論。 程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1, PD-1）是免疫球蛋白B7 超家族成員，程序性細(xì)胞死亡蛋白1 配體（programmed cell death ligand 1,PD-L1）與免疫系統(tǒng)抑制密切相關(guān)，能抑制T 細(xì)胞活化及特定細(xì)胞因子分泌，對(duì)腫瘤免疫逃逸起重要作用[5]。 既往研究指出，PD-L1 及PD-1 可介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，與腫瘤分化程度、TNM 分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)聯(lián)[6-7]。 為了探討TET 對(duì)OSCC侵襲潛能的影響及其機(jī)制，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究TET 經(jīng)HIF-1α/PD-1/PD-L1 軸對(duì)OSCC 細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移及侵襲的影響，為后期分析該藥物對(duì)OSCC 的治療機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要藥物與試劑

TET（湖北威德利化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：518-34-3）；人正常口腔上皮細(xì)胞系HOEC、OSCC 細(xì)胞系SCC25（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)：CP-H203、CL-0569）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、GAPDH 抗體（美國賽默飛科技有限公司，批號(hào)：2643863、12483020、2425734、Y1379805）；MTT、DMEM 培養(yǎng)基、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）抗體、PD-1 抗體、PD-L1 抗體、山羊抗兔二抗（美國英杰生命技術(shù)有限公司，批號(hào)：2765711、2436820、WL3457364、YA3804591、2003463、2277758）；DMSO（上?？ㄟ~舒生物科技有限公司，批號(hào)：2714422）；PBS（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)：2524465）。

1.2 主要儀器

MCO-5AC 型CO2培養(yǎng)箱（山東歐萊博醫(yī)療器械有限公司）；MH-2 型微型振蕩儀（廣州越特科學(xué)儀器有限公司）；CKX53 型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；DYCP-31DN 型電泳儀（北京鑫諾宸儀器儀表有限公司）；TE70XP 型半干電轉(zhuǎn)膜儀（美國Hoefer 公司）；ZF-258 型凝膠成像儀（上海嘉鵬儀器設(shè)備公司）；Q1000 型PCR 儀（濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將HOEC 和OSCC 細(xì)胞分別在DMEM 和RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%的胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素混合抗生素，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 采用胰酶對(duì)80%及以上融合率的細(xì)胞消化傳代。 以對(duì)數(shù)期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 以不添加TET 處理的細(xì)胞作為對(duì)照組；添加10 μmol/L TET的細(xì)胞作為低劑量組；添加20 μmol/L TET 的細(xì)胞作為中劑量組；添加30 μmol/L TET 的細(xì)胞作為高劑量組。 吸取5×105個(gè)對(duì)數(shù)生長期的SCC25 細(xì)胞，接種于6 孔板（6 份），當(dāng)其生長至80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按Lipofectamine 2000 試劑說明書，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，分別轉(zhuǎn)染HIF-1α 模擬物、HIF-1α 抑制劑；PD-1 模擬物、PD-1 抑制劑；HIF-1α 模擬物、PD-L1抑制劑。 每組均連續(xù)轉(zhuǎn)染24 h。

2.2 MTT 法檢測細(xì)胞活力

將OSCC 細(xì) 胞 置 于96 孔 板（1.5×104個(gè)/孔）中進(jìn)行傳代，保證細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，將TET 溶液加入每孔，使其濃度分別為0、5、10、20、40、50 μmol/L，每個(gè)濃度級(jí)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，加入50 μL 的MTT溶液，培養(yǎng)2 h 后分別加入DMSO（150 μL/孔）溶解沉淀，然后通過振蕩使沉淀充分溶解；采用酶聯(lián)免疫檢測儀測出每孔吸光度（opticaldensity, OD）值，波長為490 nm，讀取每組OD 值并計(jì)算平均值。 計(jì)算公式如下：細(xì)胞存活率（%）=（藥物組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力

將細(xì)胞接種在6 孔板（5×106個(gè)/孔）中培養(yǎng)。 待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，采用無菌塑料頭迅速在細(xì)胞上劃出寬度均一的痕跡，用PBS 洗滌除去懸浮的細(xì)胞。 然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)，干預(yù)完成后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)各組細(xì)胞。 在0、48 h 時(shí)間點(diǎn)下，拍攝照片，從而判定各組細(xì)胞劃痕愈合率。 計(jì)算公式如下：劃痕愈合率（%）=（愈合面積/劃痕面積）×100%。

2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力

Transwell 實(shí)驗(yàn)可評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力，細(xì)胞如突破Matrigel 膠轉(zhuǎn)移至多孔膜下表面，即為細(xì)胞具有侵襲能力。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后用胰酶消化并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于Matrigel 膠包被的Transwell 小室，孔板下室加入含有15%胎牛血清的培養(yǎng)基， 常規(guī)培養(yǎng)48 h后，將Transwell 小室取出，取出其中的培養(yǎng)液，并用PBS 沖洗干凈，孔板下室細(xì)胞通過甲醛固定30 min，通過0.1%結(jié)晶紫染色15 min，在顯微鏡下隨即選取5 個(gè)視野記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。

2.5 RT-qPCR 檢測HIF-1α、PD-1、PD-L1 表達(dá)水平

通過RNA 提取試劑盒對(duì)待測細(xì)胞進(jìn)行RNA 提取，并依照說明書逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 鏈。 通過PCR儀以cDNA 鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：94 ℃4 min，94 ℃32 s，62 ℃32 s，75 ℃3 min， 共40個(gè)循環(huán)。 基因表達(dá)值以2-ΔΔCt法[8]計(jì)算，以GAPDH 作為內(nèi)參基因。 HIF-1α 正向序列：5'-ACTTGGCAACCTTGGATTGG-3'，反向序列：5'-ATCTCCGTCCCTCAACCTCT-3'；PD-1 正向序列：5'-TAGAAATACCATTTGACCCA-3'，反向序列：5'-CCATTACTGGGTATATACCC-3'；PD-L1 正 向 序 列：5′-TCACTTGGTAATTCTGGGAGC-3′，反向序列：5′-CTTTGAGTTTGTATCTTGGATG；GAPDH 正向序列：5'-GAGAGTGCCCACTCCTGCCA-3'，反向序列：5'-CTCAGTGAGCCTCCTCTGGT-3'。

2.6 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取各組OSCC 細(xì)胞，在4 ℃下12 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），加入裂解液裂解后，加入Loading Buffer 緩沖液，選擇蛋白質(zhì)定量法（波長為562 nm）檢測各組蛋白含量，然后進(jìn)行灌膠上樣操作。 取適量樣本與SDS 樣品緩沖液混合，加熱煮沸5 min，然后4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm）后取上清液，進(jìn)行電泳分離。根據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙，在轉(zhuǎn)膜前，先用甲醇浸泡PVDF 膜3 s，然后選擇半干法轉(zhuǎn)至PVDF 膜。 將膜置于封閉緩沖液中1 h，在室溫下進(jìn)行搖動(dòng)以封閉。加入一抗纖維連接蛋白（Fibronectin）（1∶500）、波形蛋白（Vimentin）（1∶1 000）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（1∶2 000）、HIF-1α（1∶1 000）、PD-1（1∶100）、PDL1（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）在4 ℃下過夜，加入IgG 二抗（1∶2 000），37 ℃孵育1 h，取出膠片，浸入顯色液中1 min，清洗后顯影，并通過Image-Pro-Plus 軟件進(jìn)行分析，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 TET 抑制OSCC 細(xì)胞活力

細(xì)胞經(jīng)過24、48、72 h 培養(yǎng)后，隨著藥物作用時(shí)間的增加以及TET 濃度的增加，OSCC 細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。 詳見圖1。

圖1 TET 對(duì)OSCC 細(xì)胞活力的影響

3.2 TET 抑制OSCC 細(xì)胞的遷移能力

與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞的愈合率顯著降低（P<0.05），且隨劑量增加，細(xì)胞愈合率逐漸降低（P<0.05）。 詳見圖2。

圖2 TET 對(duì)OSCC 細(xì)胞遷移能力的影響

3.3 TET 抑制OSCC 細(xì)胞的侵襲能力

與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05），且隨劑量增加逐漸降低（P<0.05）；Fibronectin 和Vimentin 蛋白顯著下調(diào)（P<0.05），且隨劑量增加逐漸下調(diào)（P<0.05）；E-cadherin 蛋白顯著上調(diào)（P<0.05），且隨劑量增加逐漸上調(diào)（P<0.05）。詳見圖3—4。

圖3 TET 對(duì)OSCC 細(xì)胞侵襲能力的影響

圖4 各組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3.4 HIF-1α/PD-1/PD-L1 在OSCC 細(xì)胞系中的表達(dá)水平

與正常口腔上皮細(xì)胞比較，OSCC 細(xì)胞中HIF-1α、PD-1 和PD-L1 顯著上調(diào)（P<0.05）。 詳見圖5。

圖5 HIF-1α、PD-1、PD-L1 在正?？谇簧掀ぜ?xì)胞及OSCC 細(xì)胞系中的表達(dá)差異

3.5 TET 抑制HIF-1α、PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組HIF-1α、PD-1及PD-L1 蛋白的表達(dá)量明顯下降（P<0.05），且隨劑量增加，蛋白的表達(dá)量逐漸降低（P<0.05）。 詳見圖6。

圖6 各組HIF-1α、PD-1 及PD-L1 蛋白的表達(dá)結(jié)果比較

3.6 HIF-1α、PD-1、PD-L1 表達(dá)對(duì)OSCC 細(xì)胞的侵襲能力的影響

轉(zhuǎn)染HIF-1α 模擬物細(xì)胞的HIF-1α 相對(duì)表達(dá)量及穿膜細(xì)胞數(shù)高于轉(zhuǎn)染HIF-1α 抑制劑細(xì)胞（P<0.05），轉(zhuǎn)染PD-1 模擬物細(xì)胞的PD-1 相對(duì)表達(dá)量及穿膜細(xì)胞數(shù)高于轉(zhuǎn)染PD-1 抑制劑細(xì)胞（P<0.05），轉(zhuǎn)染PD-L1 模擬物細(xì)胞的PD-L1 相對(duì)表達(dá)量及穿膜細(xì)胞數(shù)高于轉(zhuǎn)染PD-L1 抑制劑細(xì)胞（P<0.05）。 詳見圖7—8。

圖7 HIF-1α、PD-1、PD-L1 在轉(zhuǎn)染模擬物及抑制劑細(xì)胞中的表達(dá)差異

圖8 轉(zhuǎn)染HIF-1α、PD-1、PD-L1 模擬物及抑制劑對(duì)OSCC 細(xì)胞侵襲能力的影響

4 討論

OSCC 是全球第六大常見的上皮惡性腫瘤，有較高的發(fā)病率和死亡率[9-11]。 由于此病早期癥狀隱匿，易被忽視，且具有較強(qiáng)的侵襲性，容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部侵襲，導(dǎo)致手術(shù)難以徹底清除，從而影響治療效果[12-14]。 近年來，對(duì)OSCC 的診斷和治療取得了重大進(jìn)步，但是OSCC 患者的預(yù)后仍然不理想，5 年生存率僅為50%，仍然嚴(yán)重威脅人類健康[15]。 因此，尋找新的藥物對(duì)輔助OSCC 的治療意義重大。

TET 是一種天然產(chǎn)物，具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用[16]。近年研究顯示，TET作為一種天然的抗腫瘤物質(zhì)，可抑制舌鱗癌細(xì)胞的生長[17]。 癌細(xì)胞的活力可以反映惡性腫瘤細(xì)胞的增殖速度，癌細(xì)胞活力越大，則其增殖潛力越大。 在本研究中，通過MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)過24、48、72 h培養(yǎng)后，隨著作用時(shí)間的加長以及TET 濃度的增加，OSCC 細(xì)胞活力越來越低，TET 顯著降低了OSCC 細(xì)胞的活力。 這一結(jié)果與既往研究報(bào)道的TET 可以顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活力的結(jié)果相類似[18]。 腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲等行為通?？梢宰鳛槟[瘤惡化的標(biāo)志。 本研究通過細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TET 可以抑制OSCC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且隨著TET 劑量的增加，細(xì)胞愈合率、穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低，高劑量組低于中劑量組與低劑量組，中劑量組低于低劑量組，提示TET 或存在抑制OSCC 細(xì)胞遷移與侵襲的能力。 在本研究中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低、中、高劑量TET 干預(yù)后，細(xì)胞中E-cadherin 蛋白水平顯著上調(diào)，而Vimentin 和Fibronectin 蛋白水平顯著下調(diào)。 以上結(jié)果說明TET 可以通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制OSCC 細(xì)胞的侵襲能力，與黃晏軍等[19]報(bào)道的TET可以有效抑制三陰性乳腺癌的細(xì)胞增殖和遷移的發(fā)現(xiàn)相類似。

張雅莉等[20]發(fā)現(xiàn)，PD-1 及PD-L1 在宮頸癌組織中過表達(dá)，且與患者腫瘤分化程度、TNM 分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 有研究表明，HIF-1α 過表達(dá)與癌癥及其轉(zhuǎn)移、放射治療和化學(xué)藥物治療耐藥性以及患者死亡率上升有關(guān)，且抑制HIF-1α 活性可顯著抑制血管生成和腫瘤生長[21-22]。 本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HIF-1α、PD-1、PD-L1 抑制劑細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于轉(zhuǎn)染HIF-1α、PD-1、PD-L1 模擬物細(xì)胞，表明HIF-1α、PD-1 和PD-L1 表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)OSCC 細(xì)胞侵襲能力，進(jìn)一步證實(shí)了HIF-1α/PD-1/PDL1 軸相關(guān)指標(biāo)變化對(duì)OSCC 的影響。 本研究從HIF-1α/PD-1/PD-L1 軸入手，分析了TET 對(duì)OSCC 細(xì)胞的影響，TET 處理OSCC 細(xì)胞后，HIF-1α、PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示TET 可能通過下調(diào)HIF-1α、PD-1 和PD-L1 表達(dá)，抑制OSCC 細(xì)胞侵襲。

綜上所述，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探索了TET 在OSCC 細(xì)胞中的抗癌功效，發(fā)現(xiàn)TET 可以抑制OSCC 細(xì)胞活性及遷移侵襲能力，并揭示其可能通過抑制HIF-1α/PD-1/PD-L1 軸來抑制OSCC細(xì)胞的侵襲。 但其具體作用機(jī)制還有待更深入地探索與分析。