不同產(chǎn)地、不同炮制方式連翹的主要化學(xué)成分含量及抗菌活性比較評(píng)價(jià)

王智穎，荊 綺，曹寶瑞，龐靖祥，楊美娜*，韓金祥*

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250117；2.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南250117；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南250355

連翹為木犀科植物連翹的干燥果實(shí)，味苦、微寒，有清熱解毒、疏風(fēng)散結(jié)之功[1]。 現(xiàn)代研究表明，連翹主要含苯乙醇苷類(lèi)、木脂素及其苷類(lèi)、五環(huán)三萜類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等化合物，具有抗菌[2-5]、抗炎[6-8]、抗病毒[9-10]、神經(jīng)保護(hù)[11]等藥理作用。目前，連翹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究主要集中在不同地區(qū)連翹藥材道地性、適宜采收期以及基于高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）和超高效液相色譜法（ultrahigh performance liquid chromatography, UPLC）等指紋圖譜分析[12-14]。

本研究收集了不同產(chǎn)地、不同炮制方式的連翹藥材，參考相關(guān)文獻(xiàn)[12，15]，建立了同時(shí)測(cè)定連翹中4種成分含量的UPLC，并通過(guò)測(cè)定連翹對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）來(lái)檢測(cè)不同產(chǎn)地、不同炮制方式連翹藥材的抑菌活性，分析不同產(chǎn)地及不同炮制方式對(duì)連翹藥材質(zhì)量的影響，以期為連翹的臨床使用與資源開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試藥

（+）－松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷（批號(hào)：S-029-181207）、蘆丁（批號(hào)：L-001-181216）、連翹酯苷A（批號(hào)：RFS-L01211812016）、連翹苷（批號(hào)：L-010-181106），均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司，HPLC 級(jí)，純度高于98%；金黃色葡萄球菌（北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司）；牛肉膏（Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.）；NaCl（上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；蒸餾水。 藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 連翹藥材產(chǎn)地及炮制方式

1.2 主要儀器

SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)（日本AIRTECH 公司）；YA28X6T/8 高壓蒸汽滅菌器（寧波甬安醫(yī)療器械制造有限公司）；Incucell 55 L 恒溫箱（MMM 集團(tuán)）；STIBR 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；ACOUITY 超高效液相色譜儀（Waters，配有Waters H Class 分離模塊，PDA 光電二極管陣列檢測(cè)器）；Q-POD 超凈純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；SIMF140AY65-PC 自動(dòng)制冰機(jī)（日本松下普和希公司）；VORTEX-5 渦旋儀（其林貝爾儀器制造公司）；中藥藥篩80 目（紹興市上虞滬江儀器公司）；-20 ℃冰箱（青島海爾集團(tuán)有限公司）；800C 高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）；96 孔板（浙江Sorfa 生命科學(xué)研究有限公司）。

1.3 主要化學(xué)成分含量測(cè)定[1，13-15]

1.3.1 色譜條件 ACQUITYUPLCBEHC18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。 流動(dòng)相為甲醇（A）－水（B），梯度洗脫：0～3 min，A∶B=10∶90～25∶75；3～12.5 min，A∶B=25 ∶75 ～33 ∶67；12.5 ～16.5 min，A ∶B=33 ∶67 ～38 ∶62；16.5～19.5 min，A∶B=38∶62～40∶60。 檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫28 ℃。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取（＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷對(duì)照品適量，置于10 mL 棕色容量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，搖勻，制成含（＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷0.38 g/L、蘆丁0.61 g/L、連翹酯苷A1.45 g/L、連翹苷0.71 g/L 的溶液混合對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備 取連翹粉末1.0 g （過(guò)5號(hào)篩），置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定，超聲處理（功率250 W，頻率40 KHz）40 min，放冷，再稱(chēng)定，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，上樣。

1.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.1.2”混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，得不同濃度的混合對(duì)照品溶液。按上述色譜條件測(cè)定各組分的峰面積。以各有效成分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，得線性方程（見(jiàn)表2）。 該方法在較大范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 連翹樣品超高效液相指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定峰面積，結(jié)果（＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷峰面積的RSD 分別為0.77%、0.97%、1.17%、0.50%，表明儀器精密度良好。

1.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果（＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷峰 面 積RSD 值 分 別 為1.46% 、1.84%、1.20%、0.78%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.3.7 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率試驗(yàn)方法，精密稱(chēng)取已知含量的同一連翹樣品0.5 g，平行6 份，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按“1.2.1.3”項(xiàng)下方法，分別進(jìn)行超聲提取，過(guò)濾，注入高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算回收率。 （＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷的平均回收率分別為100.28%、98.54%、99.73%、99.02%。

1.4 抗菌活性測(cè)定[16-18]

1.4.1 樣品的制備 準(zhǔn)確秤取連翹30 g， 取200 mL水，與稱(chēng)取好的連翹共同置于砂鍋中，浸泡30 min后用電陶爐加熱，火力2 200 W，煮沸后調(diào)整火力到800 W，煎煮15 min，6 層紗布濾出藥液待用，再取200 mL 水倒入鍋中重復(fù)上述煎煮步驟，合并兩次藥液，去滓，再煎至藥液剩余30 mL，終藥濃度為1 g·mL-1，將樣品溶液通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾以除去雜菌，再以2 倍稀釋法將樣品溶液用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基依次稀釋成8 個(gè)不同的濃度，備用。

1.4.2 最小抑菌濃度 （minimum inhibitory concentration, MIC）的測(cè)定 將活化好的菌種與0.45%無(wú)菌氯化鈉溶液用細(xì)菌濁度計(jì)調(diào)成0.5 麥?zhǔn)媳葷岫龋醇?xì)菌濃度1×106CFU·mL-1，再將此細(xì)菌濃度稀釋成2×103CFU·mL-1，然后在96 孔板各微孔中分別加入不同濃度的待測(cè)液100 μL 和2×103CFU·mL-1的細(xì)菌100 μL，在振蕩器上振蕩5 min，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察法判定藥物的MIC值，以抑制100%細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的濃度為判定終點(diǎn)，即MIC100。

2 結(jié)果

2.1 UPLC 測(cè)定連翹主要有效化學(xué)成分含量

2.1.1 UPLC 測(cè)定連翹主要化學(xué)成分指紋圖譜 利用連翹標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照以及結(jié)合文獻(xiàn)中連翹主要化學(xué)成分指紋圖譜分析[13-14，19]，確定了連翹提取物UPLC 圖譜中的4 個(gè)主要化學(xué)成分色譜峰，并且得到各個(gè)化學(xué)成分的線性方程。 詳見(jiàn)圖1—2、表2。

圖1 連翹混合標(biāo)準(zhǔn)品超高效液相指紋圖譜

圖2 連翹樣品超高效液相指紋圖譜

2.1.2 連翹主要化學(xué)成分含量分析 對(duì)相同產(chǎn)地、不同炮制方式連翹的主要化學(xué)成分含量進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。 與清蒸連翹相比，山西、河南及陜西產(chǎn)地的生曬連翹（＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷（β-DG）、蘆丁（RT）、連翹酯苷A（FSA）、連翹苷（PHI）的含量均顯著偏低，而僅在山西產(chǎn)地中兩種炮制方式連翹的蘆丁含量無(wú)顯著差異。 詳見(jiàn)圖3。

圖3 相同產(chǎn)地、不同炮制方式（清蒸及生曬）連翹主要化學(xué)成分含量比較

對(duì)不同產(chǎn)地、相同炮制方式連翹主要化學(xué)成分含量分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。在清蒸連翹中，與其他產(chǎn)地相比，陜西產(chǎn)地的（＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷的含量均顯著高于其他產(chǎn)地清蒸連翹中四種化學(xué)成分含量值；在生曬連翹中，陜西產(chǎn)地的松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷和蘆丁含量最高，山東產(chǎn)地的連翹酯苷A 和連翹苷含量最高。 詳見(jiàn)圖4。

圖4 不同產(chǎn)地、相同炮制方式連翹主要化學(xué)成分含量比較

2.2 連翹抗菌活性MIC 值的測(cè)定及分析

2.2.1 連翹抗菌活性MIC 值 與相同產(chǎn)地的生曬連翹相比，相同產(chǎn)地清蒸連翹的最小抑菌濃度MIC值明顯偏低，說(shuō)明清蒸連翹的抑菌作用好于同產(chǎn)地的生曬連翹。 詳見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地、不同炮制方式對(duì)連翹抗菌活性的影響

2.2.2 連翹抗菌活性MIC 值與主要化學(xué)成分含量值相關(guān)性分析 將不同產(chǎn)地、不同炮制方式連翹的抗菌活性MIC 值與主要化學(xué)成分含量值進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。 結(jié)果表明，除蘆丁外，連翹的（＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A 和連翹苷含量值均與連翹抗菌活性MIC 值存在顯著的線性負(fù)相關(guān)，說(shuō)明連翹藥材的抑菌作用與（＋）松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A 和連翹苷等主要有效成分含量存在較好的線性相關(guān)：有效成分含量越高，MIC值越低，即連翹抗菌活性越好。 詳見(jiàn)表4。

表4 不同產(chǎn)地、不同炮制方式連翹抗菌活性MIC 值與主要化學(xué)成分含量值相關(guān)性分析

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地、不同炮制方式連翹中主要化學(xué)成分及抗菌活性均存在差異。 生曬連翹的3 種化學(xué)成分含量值普遍低于相同產(chǎn)地的清蒸連翹；清蒸連翹中，陜西產(chǎn)地連翹中松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷含量值均高于其他產(chǎn)地連翹中4 種化學(xué)成分含量；生曬連翹中，陜西連翹的松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷和蘆丁含量值最高，山東產(chǎn)地連翹的連翹酯苷A 和連翹苷含量值最高。 抗菌活性研究結(jié)果表明，清蒸連翹的抗菌活性MIC 值明顯低于相同產(chǎn)地的生曬連翹，表明清蒸連翹的抗菌活性較生曬連翹更好。 基于UPLC的主要化學(xué)成分研究與抗菌活性研究共同表明，清蒸連翹的藥材質(zhì)量好于生曬連翹，這與馬梅芳[20]、王琳[21]等研究結(jié)果一致。 這是由于采用清蒸處理的連翹具有殺酶保苷[22]的作用，有效成分可以較好的保存下來(lái)。 而自然晾曬連翹內(nèi)的酶活性較強(qiáng)，有效成分降解，松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷這4 種有效成分含量均低于清蒸連翹，影響了其質(zhì)量。 綜上，基于研究結(jié)果，以陜西產(chǎn)地清蒸連翹藥材的品質(zhì)最優(yōu)。

連翹主要化學(xué)成分松脂素－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷等主要化學(xué)成分都具有抗菌[23-24]、抗炎[18，25]、抗氧化[26-27]、細(xì)胞損傷保護(hù)[28-30]等作用。 本實(shí)驗(yàn)證明，連翹煎煮液的抗菌活性與某些化學(xué)成分含量存在顯著相關(guān)性，但是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中相關(guān)性r 值較低，這說(shuō)明連翹煎煮液的抗菌活性可能并不僅僅只與連翹某幾種主要有效化學(xué)成分含量有關(guān)，可能是由于中藥植物化學(xué)成分復(fù)雜，并且經(jīng)機(jī)體代謝后可能會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物的抗菌成分，所以，一種中藥植物的抗菌活性并不是某幾種化學(xué)成分抗菌效果的單純疊加，并且連翹的抗菌作用機(jī)制也還需要進(jìn)一步研究。

本研究以連翹藥材為例，為不同產(chǎn)地、不同炮制方式中藥材的區(qū)分及其質(zhì)量評(píng)估提供了研究基礎(chǔ)。因此，對(duì)藥材的道地性質(zhì)量評(píng)價(jià)也不應(yīng)僅僅根據(jù)主要化學(xué)成分含量值高低，而應(yīng)結(jié)合連翹藥材的各種藥理作用對(duì)藥材進(jìn)行整體評(píng)價(jià)，從而為中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更為全面的參考。