基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實驗探討瓜蔞-薤白藥對抗動脈粥樣硬化的作用機制

賈子君，周慶兵，張 艷，徐鳳芹*

1.中日友好醫(yī)院，北京100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，北京100091

以動脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）為病理基礎(chǔ)的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease, CHD）是目前導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一[1-2]。 在過去30 年中，他汀類藥物奠定了AS 類疾病的治療基石。 然而，在臨床實際使用中發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物存在相對較多的不良反應(yīng)，包括增加患糖尿病的風(fēng)險以及引起肌肉疼痛等，這些不良反應(yīng)限制了他汀類藥物的使用[3]。 越來越多的證據(jù)表明，中醫(yī)藥在對包括CHD 在內(nèi)的AS類疾病的預(yù)防、治療和康復(fù)方面發(fā)揮重要作用[4]，值得進一步深入挖掘。

中醫(yī)學(xué)并無AS 的對應(yīng)疾病病名，根據(jù)AS 類疾病的常見臨床癥狀表現(xiàn)，可將其歸于“胸痹”“眩暈”等范疇[5]。 瓜蔞-薤白藥對（Gualou-Xiebai herb pair,GXHP）是《金匱要略》中治療胸痹的常用藥對，其中瓜蔞性寒，味甘、苦，能寬胸散結(jié)、清潤化痰；薤白性溫，味辛、苦，可溫中通陽、行氣散結(jié)、活血止痛。千百年來，GXHP 一直是治療AS 類疾病最常用的藥對，經(jīng)典名方瓜蔞薤白白酒湯在治療CHD 心絞痛時療效顯著，可有效降低患者的血脂及血液黏度[6]。田盼盼等[7]通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)，瓜蔞薤白半夏湯合丹參飲能有效緩解不穩(wěn)定型心絞痛痰瘀互結(jié)證患者心絞痛的臨床癥狀，降低患者的血脂，減少發(fā)作次數(shù)及硝酸甘油的用量。 但GXHP 抗AS 的作用機制仍不清楚，從而限制了其進一步運用，因而有必要從現(xiàn)代生物學(xué)角度闡明其抗AS 的效應(yīng)機制。

本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與體外實驗結(jié)合，探討GXHP 抗AS 的效應(yīng)機制。 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測GXHP 中的主要成分，篩選出GXHP 在AS 治療中的核心靶點、相關(guān)信號通路，并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)。 在細(xì)胞實驗部分，運用CCK-8 檢測GXHP 對Raw264.7細(xì)胞的增殖抑制作用，以此確定后續(xù)的藥物作用濃度，以氧化型低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein, ox-LDL）處理Raw264.7 細(xì)胞構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型，并利用該模型評估GXHP 的抗AS 效應(yīng)，包括抗炎與降脂效應(yīng)。最后，采用Western blot 法對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的信號通路進行驗證。

1 材料和方法

1.1 主要藥物與試劑、儀器

1.2 GXHP 成分篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/index.php）獲取瓜蔞與薤白所含化合物，結(jié)合吸收、分布、代謝及排泄評價指標(biāo)，根據(jù)藥代動力學(xué)特性，以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%和類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18 為限定條件對所收集到的化合物進行篩選[8]。

1.3 藥物-成分-分子靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）確定GXHP 的成分靶點。從OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、Drugbank 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.drugbank.ca/）以及Therapeutic Target 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.org/ttd/）等數(shù)據(jù)庫中獲取AS 的靶點，并與GXHP 的成分靶點取交集。 使用Cytoscape 3.7.7軟件構(gòu)建藥物-成分-分子靶點-AS 的網(wǎng)絡(luò)圖。 在本研究中，大于Degree 值中位數(shù)2 倍的節(jié)點被選為核心靶點。

1.4 PPI 構(gòu)建

為了更好地理解核心靶標(biāo)之間的相互作用，應(yīng)用STRING 3.0（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。限定物種為Homo sapiens（智人），并選擇置信度≥0.9作為篩選條件，使用Cytoscape 3.7.7 軟件對結(jié)果進行可視化展示。

1.5 京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）信號通路富集分析

將篩選到的核心靶點運用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行KEGG 富集分析，得到GXHP治療AS 的關(guān)鍵信號通路，根據(jù)P<0.01 的標(biāo)準(zhǔn)，使用R 語言對KEGG 的前15 條結(jié)果進行可視化展示。

1.6 泡沫細(xì)胞模型建立

Raw264.7 細(xì)胞株由中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心提供，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的孵育箱中進行培養(yǎng)，在細(xì)胞密度達80%左右時進行傳代。 參考既往文獻資料[9]，以ox-LDL 處理Raw264.7 細(xì)胞48 h，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒。

1.7 油紅O 染色

使用異丙醇（分析純級）溶解油紅O 粉末，制備0.5 w/v 濃度的油紅O 原液，使用時將油紅O 原液與去離子水以3∶2 比例進行稀釋，使用雙層濾紙過濾3 次，室溫放置10 min，棄下層沉淀。 使用6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞，負(fù)壓棄去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定20 min，吸出多聚甲醛溶液，加入油紅O 染色液靜置10 min，使用自來水緩慢漂洗，對背景進行脫色處理，直至去除染色液，放置在顯微鏡下觀察、拍照。

1.8 CCK-8 觀察GXHP 對Raw264.7 細(xì)胞的增殖抑制作用

制備細(xì)胞懸液，密度為1×105個/mL，接種于96孔板中，4 h 后加入含有不同濃度GXHP 的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后棄去藥液，加入培養(yǎng)液與CCK-8 試劑的混合液（比例為9∶1），1 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm 處進行吸光度的檢測，計算各組的細(xì)胞存活率，根據(jù)細(xì)胞存活率確定后續(xù)實驗的藥物處理濃度。

1.9 氣相色譜質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）檢測GXHP 的降脂效應(yīng)

將細(xì)胞分為5 組，分別為空白組（無處理）、模型 組（80 μg/mL ox-LDL 處理）、GXHP 低劑量組（80 μg/mL ox-LDL+0.2 g/L GXHP）、GXHP 中劑量組（80 μg/mL ox-LDL+0.6 g/L GXHP）和GXHP 高劑量組（80 μg/mL ox-LDL+1.8 g/L GXHP），于6 孔板中培養(yǎng)，處理48 h 后采集各組細(xì)胞進行GC-MS檢測。 步驟如下：（1）總膽固醇（total cholesterol, TC）樣本，取樣品0.5 mL，加入3 mL 無水乙醇、2 mL 60%氫氧化鉀，100 ℃回流1 h 后加5 mL 10%氯化鈉溶液、2 mL 石油醚與乙醚混合液（石油醚∶乙醚=1∶1），振搖后離心取上層進樣；（2）游離膽固醇（free cholesterol, FC）樣本，量取樣品0.5 mL，加10%氯化鈉2 mL 后混勻，加石油醚、乙醚混合物2 mL，振搖后離心取上層進樣；（3） 設(shè)置氣相色譜質(zhì)譜儀參數(shù)，采用Rtx-5MS 色譜柱，進樣口溫度設(shè)置為280 ℃，升溫程序為150 ℃保持1 min，以40 ℃/min 升至300 ℃，保持7 min。

床層復(fù)氧可采取數(shù)種方式加以強化：①干濕交替的間歇運行方式；②床內(nèi)設(shè)置通氣管進行自然或強制復(fù)氧；③利用植物的根系對系統(tǒng)內(nèi)部進行復(fù)氧，這項研究國內(nèi)外已有相關(guān)進展。

1.10 ELISA 法檢測GXHP 的抗炎效應(yīng)

分組同上，處理48 h 后采集各組細(xì)胞上清液進行ELISA 檢測，按照檢測試劑盒說明書中的步驟進行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值，使用Excel軟件計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD 值計算出對應(yīng)樣本中炎癥因子（IL-6、ICAM-1）的濃度。

1.11 Western blot 檢測GXHP 對MAPK 信號通路的作用

分組同上，處理48 h 后收集各組細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，BCA 法測定各組蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳3 h，隨后將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上，以TBST 洗膜后封閉1 h，洗膜后加入不同比例一抗并室溫孵育過夜，各一抗比例如下：抗p-ERK（1∶500）、抗ERK（1∶1 000）、抗p-p38（1∶1 000）、抗p38（1∶1 000）、抗NF-κB-p65（1∶1 000）和抗NF-κB p-p65（1∶1 000）。 再次洗膜后加入二抗，使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑，于曝光機曝光，掃描后使用Quantity One 分析目標(biāo)條帶灰度值，做定量統(tǒng)計。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GXHP 活性成分

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到GXHP 中具有相關(guān)作用靶點的成分21 個，包括10 種來自瓜蔞的成分和11 種來自薤白的成分。 成分相關(guān)信息分別列于表1和表2。

表1 瓜蔞的活性成分

表2 薤白的活性成分

2.2 GXHP-活性成分-AS 靶點網(wǎng)絡(luò)

通過GeneCards、Drugbank、GeneCards 以及Therapeutic Target 等數(shù)據(jù)庫共確定34 012 個AS 疾病相關(guān)靶點。 將GXHP 中主要成分對應(yīng)的作用靶點與34 012 個AS 相關(guān)靶點取交集，得到21 種主要成分，共對應(yīng)154 個作用靶點，進一步通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫?6 個核心靶點，包括JUN、STAT3、MAPK3 和AKT1等，使用Cytoscape 3.7.7 軟件構(gòu)建藥物-GXHP 活性成分-AS 靶點網(wǎng)絡(luò)。 詳見圖1。

圖1 藥物-GXHP 活性成分-AS 靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GXHP 核心靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

將36 個核心靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖。 圖2 顯示JUN、STAT3、MAPK3、AKT1 等在網(wǎng)絡(luò)圖中占有核心位置。

圖2 36 個核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 KEGG 富集分析

將36 個核心靶點導(dǎo)入DAVID 6.8 在線數(shù)據(jù)分析平臺，進行KEGG 富集分析。 按P 值升序排列，選取前15 條KEGG 信號通路進行展示。 圖3 顯示GXHP 治療AS 的核心靶點涉及脂質(zhì)與AS、MAPK和PI3K-Akt 等信號通路。

圖3 GXHP 核心靶點KEGG 富集分析氣泡圖

2.5 GXHP 對Raw264.7 細(xì)胞的增殖抑制作用

CCK-8 結(jié)果顯示，GXHP 在0～2.0 g/L 之間，48 h處理后細(xì)胞的存活率可達95%以上。與0 g/L 比較，4、8、16、32 g/L GXHP 細(xì)胞存活率降低（P<0.01）（圖4）。 為避免GXHP 的細(xì)胞毒性作用，本研究在后續(xù)實驗中選擇1.8、0.6、0.2 g/L 分別作為GXHP 高、中、低劑量組濃度。

圖4 GXHP 對Raw264.7 細(xì)胞存活率的影響（48 h，±s，n=3）

2.6 GXHP 對泡沫細(xì)胞TC、FC 及ICAM-1、IL-6 的影響

油紅O 染色結(jié)果顯示，經(jīng)ox-LDL 處理后，空白組細(xì)胞中無橙紅色脂滴（圖5A），模型組細(xì)胞內(nèi)可見大量橙紅色脂滴（圖5B）。

圖5 油紅O 染色結(jié)果（×200）

與空白組比較，模型組中TC 及FC 的表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，GXHP 高、中劑量組TC 及FC 的表達顯著降低（P＜0.01）（圖6A、B）。

圖6 GXHP 對泡沫細(xì)胞脂質(zhì)和炎癥因子的表達作用（±s，n=5）

與空白組比較，模型組細(xì)胞上清液中IL-6、ICAM-1 的表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，GXHP高、中、低劑量組IL-6 的表達水平明顯下調(diào)（P＜0.01）；GXHP 高、中劑量組ICAM-1 的表達水平明顯下調(diào)（P＜0.01）（圖6C、D）。

2.7 GXHP 抑制MAPK 信號通路核心蛋白的表達

與空白組相比，模型組泡沫細(xì)胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-p65/p65 的相對表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，GXHP 高、中、低劑量組中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-p65/p65 相對表達水平明顯降低（P<0.05 或P<0.01）。 詳見圖7。

圖7 GXHP 對各組p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-p65/p65 相對蛋白表達水平的影響（±s，n=3）

3 討論

AS 是包括CHD 在內(nèi)眾多疾病的主要病理基礎(chǔ)，是目前導(dǎo)致人口死亡的主要原因。GXHP 為張仲景治療胸痹的最常用藥對，在防治AS 類疾病中顯示出了其獨特的臨床療效，如劉麗清等[10]使用瓜蔞薤白半夏湯治療心絞痛患者獲得了良好的臨床效果。 周宏偉等[11]發(fā)現(xiàn)，瓜蔞薤白半夏湯在治療CHD患者時可抑制炎癥因子的表達。彭喜洋等[12]發(fā)現(xiàn)，瓜蔞薤白半夏湯加減能顯著降低CHD 痰濁痹阻證患者的血脂水平且提高患者心功能。然而，關(guān)于GXHP抗AS 的分子機制的報道較少，這限制了其治療AS的臨床應(yīng)用范圍。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)目前已被廣泛用于揭示中藥的分子作用機制[13]。 在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)GXHP 有21個可能的活性成分，包括槲皮素、柚皮素、葫蘆素D和香葉木素。 同時確定了GXHP 活性成分對應(yīng)的36個核心作用靶點，包括JUN、STAT3、MAPK3 和AKT1等，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了藥物-成分-分子靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。 與此同時，對36 個核心靶點進行KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)GXHP 治療AS 的核心靶點涉及脂質(zhì)與AS、MAPK 和PI3K-Ak 等信號通路。 既往研究表明，MAPK 信號通路與AS 疾病的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[14]。NEWBY 等[15]和ELKHAWAD 等[16]進一步發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK 信號通路可以減少AS 患者的血管炎癥。 因此，我們選擇MAPK 信號通路作為GXHP 體外抗AS 效應(yīng)機制的靶通路，進行實驗驗證。

巨噬細(xì)胞攝取大量ox-LDL 可形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的形成是AS 早期病變的標(biāo)志性事件[17-18]。此外，泡沫細(xì)胞在受到ox-LDL 刺激后還會釋放出大量的促炎癥因子，進一步加速AS 的發(fā)展[19-20]。 因此，泡沫細(xì)胞模型可用來評估藥物的抗AS 效應(yīng)及作用機制[21-22]。在本研究中，我們以80 μg/mL 的ox-LDL 處理Raw264.7 細(xì)胞48 h，油紅O 染色觀察到細(xì)胞內(nèi)有大量橙紅色脂滴顆粒，提示造模成功。CCK-8結(jié)果顯示，GXHP 對Raw264.7 細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，為了避免GXHP 對Raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，在后續(xù)實驗中，選擇1.8、0.6、0.2 g/L分別作為GXHP 高、中、低劑量組的處理濃度來觀察GXHP 的抗AS 效應(yīng)及相關(guān)機制。

炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致AS 發(fā)病及進展的一個核心機制，其中IL-6 可由巨噬細(xì)胞釋放，能夠增強局部炎癥反應(yīng)，是參與AS 病變及進展的重要炎癥因子[23]。ICAM-1 屬于免疫球蛋白家族，ICAM-1 的大量表達則增強了單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，促進AS炎癥的發(fā)生和發(fā)展，還能加重脂質(zhì)代謝的紊亂[24]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)經(jīng)ox-LDL 處理后，細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子ICAM-1 和IL-6 明顯升高。更重要的是，GXHP 不僅能降低TC 和FC 的水平，還能減少炎癥因子ICAM-1 和IL-6 的表達，提示GXHP 具有顯著的抗AS 效應(yīng)。

為進一步探索GXHP 抗AS 作用的分子機制，我們觀察了GXHP 處理后各組MAPK 信號通路核心蛋白ERK、p38 和p65 等的表達變化。MAPK 級聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式之一，參與多種細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的調(diào)節(jié)。MAPK 信號通路在未受刺激時，處于靜止?fàn)顟B(tài)，受到炎性刺激時，在上游激酶的作用下，發(fā)生級聯(lián)磷酸化而激活，MAPK 被激活后進入細(xì)胞核，使一些轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，參與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等細(xì)胞過程的調(diào)控，其核心蛋白包括p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38、p38 等。 大量的基礎(chǔ)研究證實，MAPK 信號通路的激活是AS 發(fā)生和發(fā)展的重要因素，與炎癥、血管內(nèi)皮與平滑肌細(xì)胞的增殖遷移密切相關(guān)。 如動物實驗發(fā)現(xiàn)，ERK、p38 的激活均可促進內(nèi)膜增厚和血管平滑肌細(xì)胞的增殖，而抑制ERK、p38 能夠減少AS 斑塊的形成[25]；ZHAO等[26]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK 信號通路可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2 表型，減緩炎癥的發(fā)生，對AS有保護作用。 WANG 等[27]認(rèn)為，抑制p38 MAPK 的激活可減少ox-LDL 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎作用，起到抗AS 的作用。同時，研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ參與內(nèi)皮損傷和炎癥，加速AS，應(yīng)用p38 MAPK 抑制劑可以抑制血管緊張素Ⅱ?qū)?nèi)皮損傷及炎癥的影響[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組細(xì)胞中p-ERK、p-p38 和p-p65 的表達水平明顯增加，而GXHP 能降低處理組泡沫細(xì)胞中p-ERK、p-p38 和p-p65 的表達水平。

綜上，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與體外實驗的研究表明，GXHP 可能通過抑制MAPK 信號通路實現(xiàn)抗AS 效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)的活性成分如槲皮素、柚皮素、葫蘆素D和香葉木素，以及GXHP 的核心靶點包括JUN、STAT3、MAPK3 和AKT1 等，為未來進一步深入進行抗AS研究奠定了基礎(chǔ)。中醫(yī)藥治療AS 引起的CHD、心絞痛等疾病具有良好的療效，且具有藥物價格低及不良反應(yīng)少等優(yōu)勢，有著不可替代的地位。本研究僅基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實驗探究GXHP 抗AS 的作用機制，缺乏對GXHP 中的有效成分研究。 在今后的研究中，我們將進一步明確其活性成分并對其深入研究。中醫(yī)藥在治療心系疾病方面有著悠久的歷史，我們相信深入研究中醫(yī)藥防治AS 的機制，將為AS疾病的預(yù)防和治療提供更好的方案。