基于網絡藥理學和實驗驗證研究加味獨活寄生合劑治療腰椎間盤突出癥的作用機制

蔣浩波，段嘉豪，劉恩旭，陳 茜，李 夏，邵 樂，楊少鋒*，張 曉*

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007；3.廣東醫科大學公共衛生學院，廣東 東莞523808

近幾十年來，腰痛已成為影響人們生活質量最為重要的筋骨疾患之一[1]。 相關研究表明，高達84%的人在其一生中都可能會受到腰痛的困擾[2]。 其中，腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation, LDH）是導致腰痛最為常見的原因之一[3]，它的發生與腰椎退行性改變密切相關。 LDH 指椎間盤發生退行性改變后，由于纖維環部分或全部破裂，單獨或連同髓核、軟骨終板向外突出，刺激或壓迫脊髓、神經和血管等組織，引起以腰腿痛為主要癥狀的病變。 椎間盤主要由上下終板軟骨（endplate cartilage, EPC）、纖維環（annulus fibrosus, AF）、纖維環包裹的髓核（nucleus pulposus, NP）組成。 由于椎間盤內無血管分布，其營養主要依靠終板軟骨的擴散。 隨著人年齡的增長，終板軟骨細胞發生退變，終板軟骨的營養供給功能障礙，導致椎間盤衰老變性，進而引起LDH[4-5]。

LDH 歸屬于中醫學“痹病”范疇，相關研究表明中醫在LDH 的保守治療中療效顯著[6]。腰為腎之府，腎主骨，生髓，為先天根本；肝為藏血之臟，在體合筋；當肝腎虧虛時，則精血生發較少，無法滋骨絡髓，無法榮筋，而發腰痹，所以肝腎虧虛為LDH 的主要內因。 因此，以獨活寄生湯為代表的經典方劑，在治療LDH 方面得到了廣泛應用[7-8]。加味獨活寄生合劑是在獨活寄生湯的基礎上，經臨床辨證論治、三因制宜對藥味、藥量進行加減的院內制劑，其對于痹病（風寒濕痹、肝腎不足）有著良好的臨床療效，在保守治療的情況下，加味獨活寄生合劑治療LDH 有效率達到80%[9]。

因中藥復方成分的復雜性和靶點的不確定性，常規藥理研究方法難以全面闡明加味獨活寄生合劑治療LDH 的分子作用機制。網絡藥理學作為藥理學新興分支學科，在揭示化學成分復雜的中藥復方的藥理學規律上具有獨特的優勢，其整體性、系統性與中醫藥的整體觀、辨證論等基本理論趨于一致[10-11]。 因此，本研究設計通過網絡藥理學技術獲取加味獨活寄生合劑干預LDH 交集靶標，得到交集靶標以及富集通路，并預測相關機制；最后通過大鼠椎間盤軟骨終板細胞的體外實驗進行驗證，為深入探討加味獨活寄生合劑干預LDH 的機制提供可靠的理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

健康1 月齡SPF 級SD 大鼠20 只，雄性，質量（200±20） g；由湖南中醫藥大學動物實驗中心代購。質量合格證編號為：ZS-202209200008。 對于動物的實驗操作均經過湖南中醫藥大學倫理委員會審核，倫理號為：LLBH-202209050004。大鼠4 只用于原代終板軟骨細胞的提取；8 只用于加味獨活寄生合劑含藥血清的提取，8 只用于無藥血清的提取。

1.2 實驗用藥

加味獨活寄生合劑，批號：2022111，湘藥制備字：Z20190063，規格：每瓶250 mL。 主要成分：獨活、桑寄生、天南星、黃芩、木瓜、威靈仙、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風、川芎、人參、甘草、當歸、白芍、熟地黃。 生藥濃度為0.664 g/mL。

1.3 主要試劑及儀器

CCK-8 細胞活力檢測試劑盒（批號：PN659）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；PBS 緩沖液（批號：PB180327）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；IL-6 ELISA 試劑盒（批號：Y17039786）購自武漢華美生物工程有限公司；重組人IL-17（批號：Q16552）購自美國PeproTech 公司；DAPI（批號：C1005）購自上海碧云天生物技術有限公司；Collagen Ⅱ抗體（種屬：兔）（批號：ab34712）購自英國Abcam 公司；Trizol試劑（批號：5301100）購自美國Thermo 公司；mRNA逆轉錄試劑盒（批號：E047-01B）購自中國北京康為世紀；p-p65 抗體（批號：3033S）、MMP9 抗體（批號：2270S）；GAPDH 抗體（批號：2118S）以上抗體均購自美國CST 公司。

A00-1-1102 型流式儀（Beckman 公司）；PW-812 型全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司）；MB-530 型多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司）；PIKOREAL96 型熒光定量RCP 儀（美國Thermo 公司）；DYY-2C 型電泳儀、DYCP-31DN 型水平瓊脂糖電泳槽（中國北京六一公司）；GL-88B 型旋渦混合器（中國江蘇其林貝爾公司）。

2 方法

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 獲取交集靶標 應用TCMSP 數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及BATMAN-TCM 數據庫（http:/bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索加味獨活寄生合劑所有組成藥物的活性成分。 篩選出類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%的化合物作為研究對象， 然后基于該數據庫，將納入的活性成分逐一配對潛在作用靶點。 再通過UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）進行靶點蛋白和基因信息注釋，限定物種為“Homo sapiens”，得到加味獨活寄生合劑主要活性成分的預測靶點。 通過GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數 據 庫（https://omim.org/）搜集LDH 相關的疾病靶點，并將化合物作用靶點與疾病靶點取交集，獲取加味獨活寄生合劑干預LDH的交集靶標。

2.1.2 構建“藥物-化合物-疾病靶標”網絡模型 將交集靶標入Cytoscape 3.7.0 軟件中構建“藥物－化合物－疾病靶標”網絡圖以備后續分析。 其中節點的類型代表藥物成分、疾病和交集靶標，利用CentiScape插件計算有效成分的度值，度值越高提示發揮主要功能的概率越大。

2.1.3 構建PPI 網絡獲取核心靶蛋白 將獲得的交集靶標輸入STRING（https://string-db.org/）數據庫，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，將Settings 設為“high confidence：0.7”，其他參數保持默認設置，獲得PPI 網絡。 并導入Cytoscape 3.7.0 繪制蛋白質間相互作用網絡并進行網絡拓撲分析，根據度值大于中位數篩選出核心靶蛋白。

2.1.4 GO 分析及KEGG 通路富集分析獲取關鍵通路 用R 語言（https://www.r-project.org/）軟件中clusterProfiler GO.R 插件及Perl 語言對活性成分與LDH 的交集靶標進行GO 分析。 并應用clusterProfilerKEGG.R 插件進行KEGG Pathway 通路富集分析。根據富集因子值分析核心通路富集程度，探究加味獨活寄生合劑治療LDH 的可能的生物功能及信號通路機制。

2.2 體外實驗驗證

2.2.1 終板軟骨細胞的提取、培養和鑒定 取健康1 月齡SD 大鼠4 只，使用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，脊柱脫臼法處死，使用75%乙醇浸泡5 min，移至超凈工作臺。 俯臥固定大鼠，剪開被毛，暴露完整椎體，取出椎間盤終板軟骨組織。將組織用無菌PBS 清洗3 次， 剪碎至1 mm3大小，加入5 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶消化液，37 ℃恒溫搖床，震蕩消化2～3 h。吹打組織30 次，經過200 目細胞篩過濾，濾液1 000 r/min 離心5 min，離心半徑9 cm。去除上清液后，用含10%胎牛血清以及1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM 培養液將收集的終板軟骨細胞重懸，并接種在25T 的培養瓶內，放置在恒溫培養箱（37 ℃、5% CO2）中培育。24 h 后觀察細胞貼壁情況，若貼壁情況良好，則3 d 后對細胞進行第一次換液，之后每隔2～3 d 換一次液。 當第三代細胞增長至80%后取出細胞，通過細胞形態學觀察以及CollagenⅡ免疫熒光染色進行鑒定，鑒定成功后，取出第三代終板軟骨細胞進行后續實驗。

2.2.2 加味獨活寄生合劑藥液的制備 采取蒸餾法，濃縮藥液至2 g/mL。

2.2.3 含藥血清的制備 1 月齡SD 大鼠16 只，適應性喂養7 d，按隨機數表法分為加味獨活寄生合劑組和生理鹽水組。 按照藥理試驗中動物與人體間的等效劑量換算[12]。 加味獨活寄生合劑參考人體劑量（1.186 g·kg-1·d-1），并按人（70 kg）和大鼠（200 g）體表面積折算等效劑量，大鼠等效劑量約為7.35 g·kg-1·d-1。 據相關研究表明，當大鼠灌胃劑量達到臨床等效劑量5 倍時取得的大鼠含藥血清質量最高[13]，因此，大鼠需要藥物劑量為36.75 g·kg-1·d-1。 濃縮后的藥液需要灌18.375 mL·kg-1·d-1，生理鹽水組灌等量的生理鹽水，分早晚兩次灌胃。 灌胃第7天給藥1 h 后，使用3%的戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，常溫靜置3 h；以3 000 r/min、離心半徑9 cm、4 ℃條件下離心15 min，按組收集血清。 將各組血清組內混合，減少個體差異。 于56 ℃的恒溫水浴鍋中放置30 min 滅活，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，保存在1.5 mL 離心管內，做好標記，放置-80 ℃冰箱保存備用。

2.2.4 造模方法 使用添加含有10 ng/mL 的IL-17 的DMEM 培養液對第3 代終板軟骨細胞進行培養，經過24 h 誘導后形成終板軟骨細胞退變模型[14]。通過倒置顯微鏡、甲苯胺藍染色以及CollagenⅡ免疫熒光染色鑒定細胞并觀察細胞退變情況。

2.2.5 含藥血清毒性檢測 終板軟骨細胞以5×103個/cm3的密度接種到96 孔板中，分別加入200 μL含有0%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%含藥血清的基礎培養基干預24 h。干預后，將含10%CCK-8 的100 μL 基礎培養基加入孔板，37 ℃孵育2 h。 使用酶標儀檢測波長在450 nm 處測量每個孔的吸光度值（optical density, OD）值。 檢測細胞活性，分析含藥血清毒性。 CCK-8 實驗計算細胞活力，細胞活力（%）=[（實驗孔-空白孔）/（對照孔-空白孔）]×100%。

2.2.6 分組及干預 取P3 代終板軟骨細胞，按隨機數字表法隨機分成5 組：空白對照組、模型對照組、加味獨活寄生合劑低劑量組（簡稱低劑量組）、加味獨活寄生合劑低劑量組中劑量組（簡稱中劑量組）、加味獨活寄生合劑高劑量組（簡稱高劑量組）。 除空白對照組外，其他4 組均采用IL-17 干預大鼠的椎間盤終板軟骨細胞。 IL-17 干預細胞后使用不同濃度含藥及空白血清干預各組細胞。

各組具體干預方式為：空白對照組：20%空白血清+DMEM；模型對照組：20%空白血清+DMEM+10 ng/mL IL-17；低劑量組：5%含藥血清+15%空白血清+DMEM+10 ng/mL IL-17；中劑量組：10%含藥血清+10%空白血清+DMEM +10 ng/mL IL-17；高劑量組：20%含藥血清+DMEM+10 ng/mL IL-17。

2.2.7 各組終板軟骨細胞的細胞活性檢測 為了測定各組細胞增殖活性情況，將終板軟骨細胞以5×103個/cm3的密度接種到96 孔板中。 完成上訴干預后，將含10% CCK-8 的100 μL 基礎培養基加入孔板，37 ℃孵育2 h。 使用酶標儀檢測波長在450 nm處測量每個孔的OD 值，計算細胞活力。

2.2.8 各組終板軟骨細胞的細胞周期情況檢測 胰酶消化收集各組細胞，PBS 沖洗3 遍，1 000 r/min，離心半徑9 cm，3 min 收集細胞沉淀。 加入1 mL 70%的預冷的乙醇固定細胞24 h；重懸離心2 遍去除乙醇后，加入200 μL 碘化丙啶（PI）工作液，4 ℃避光染色30 min。 轉至流式檢測管，上機檢測，PI 用488 nm 氬離子激光器激發，由630 nm 通濾光片接收，通過FSC/SSC 散點圖收集10 000 個細胞，采用設門技術，排除粘連細胞和碎片，分析PI 熒光直方圖上各細胞周期的百分率。

2.2.9 ELISA 檢測各組細胞IL-6 的表達 收集各組干預完成后的細胞上清液，分別設標準孔和待測樣本孔，操作步驟按照試劑盒說明進行。 用酶標儀在450 nm 波長依序測量各孔的光密度OD 值。 以標準品的濃度為縱坐標，OD 值為橫坐標，使用Curve Expert 軟件進行分析，計算出樣本濃度。

2.2.10 實時熒光定量PCR 檢測各組細胞p-p65、MMP9 的基因表達 應用Trizol 試劑提取各組細胞總RNA。按照試劑操作盒說明書進行逆轉錄反應得到cDNA，作為擴增模板，擴增條件如下：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，40 個循環，熔解曲線分析：60 ℃- 95 ℃。 根據2-△△Ct法計算目標mRNA 的相對表達量，上下游引物由北京擎科生物科技有限公司合成；引物序列：p-p65：正向5'-CCGATGCATCCACAGTTCCC-3'， 反 向5'-TGGGGGCACGGTTAT CAAAA-3'，長度：156 bp。 MMP9：正向5'-AGGGCCCCTTTCTTATTGCC-3'，反向5'-CACATTTTGCGCCCAGAGAA-3'，長度：112 bp。 GAPDH：正向5'-TCACTATGAGGTCTACTCGG-3'，反向5'-CATATTGCCAGTTCTTCGTA-3'，長度：141 bp。

2.2.11 Western blot 法 檢測 各組p-p65、MMP9 的表達 各組細胞干預24 h 后棄上清，PBS 洗滌后加入細胞裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）， 冰上裂解30 min 后12 000 r/min，離心半徑5 cm，離心15 min，吸取上清并加入緩沖液，100 ℃金屬浴5 min 后放入-80 ℃凍存。 選用8%～12%的分離膠進行電泳，隨后將蛋白轉移至PVDF 膜上，使用5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入稀釋后的一抗（1∶1000）放入4 ℃過夜，TBST 清洗3 次，8 min 后用稀釋后的二抗（1∶5000）孵育1 h， 再次使用TBST 洗膜后加入ECL 液上機顯影。 內參為GAPDH，使用Image J 軟件分析pp65、MMP9 蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 網絡藥理學分析結果

3.1.1 加味獨活寄生合劑治療LDH 的潛在靶點的確定 通過TCMSP 數據庫及BATMAN-TCM 數據庫檢索并經文獻補充后，共篩選出加味獨活寄生合劑19 種藥物共計295 種活性成分，見圖1A。 通過TCMSP 數據庫獲取及SwissTarget 數據庫預測的靶點經UniProt 數據庫規范化處理，得到257 個活性成分作用靶點，通過GeneCards、OMIM 數據庫共搜集得到498 個LDH 疾病靶點，加味獨活寄生合劑與LDH 兩者的交集靶標為50 個，見圖1B。

圖1 加味獨活寄生湯中有效活性成分分布情況及藥物－疾病靶標交集情況

3.1.2 加味獨活寄生合劑干預LDH 的“藥物－化合物－疾病靶標”網絡模型的構建 將交集靶標入Cytoscape 軟件中構建“藥物－化合物－疾病靶標”網絡圖，見圖2。 其中節點的類型代表藥物成分、疾病和交集靶標，利用“CentiScape”插件計算有效成分的度值，度值越高提示發揮主要功能的概率越大。 在“藥物－化合物－疾病靶標”網絡模型中，該網絡的度值的中位數為9，大于該值的活性成分有槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、山柰酚，提示它們在加味獨活寄生合劑干預LDH 中發揮主要功能。

圖2 加味獨活寄生合劑干預LDH 的“藥物－化合物－疾病靶標”網絡模型

3.1.3 加味獨活寄生合劑干預LDH 的PPI 的構建及核心靶蛋白的獲取 將獲得的交集靶標輸入STRING 數據庫，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，將Settings 設為“high confidence：0.7”，其他參數保持默認設置，獲得PPI 網絡。并導入Cytoscape 軟件繪制PPI 網絡圖并進行網絡拓撲分析，根據度值大于中位數篩選出核心靶蛋白，如圖3A所示。 此網絡的度值中位數為13.4，以此為標準篩選出核心靶蛋白16 個，如圖3B 所示，IL-6 靶蛋白的度值最高，提示最可能是加味獨活寄生合劑干預LDH 的核心靶點。

圖3 加味獨活寄生合劑干預LDH 的PPI 網絡圖及核心靶蛋白

3.1.4 加味獨活寄生合劑活性成分-LDH 靶點GO功能及KEGG 通路富集分析 通過clusterProfiler GO.R 插件及Perl 語言對活性成分與LDH 的交集靶標進行GO 分析獲取1 294 生物功能、22 條細胞功能以及70 種分子功能，如圖4A 所示。 應用clusterProfilerKEGG.R 插件進行KEGG 通路富集分析。 如圖4B 所示，KEGG 富集分析中IL-17 相關信號通路富集的集因子值較高，提示其可能為關鍵通路。

圖4 加味獨活寄生合劑干預LDH 的GO 功能（A）及KEGG 通路富集（B）分析

3.2 體外實驗驗證

3.2.1 終板軟骨細胞及其退變模型鑒定 倒置顯微鏡下細胞貼壁生長，細胞形態為梭形并多角形，見圖5A。 甲苯胺藍染色顯示，細胞核被染色為藍色，細胞質及胞漿被染為淡藍色，見圖5B。CollagenⅡ免疫熒光染色鑒定結果顯示，胞漿熒光為紅色，細胞核不著色，見圖5C。 據此可鑒定提取培養的細胞為終板軟骨細胞。

圖5 終板軟骨細胞的鑒定

IL-17 刺激誘導終板軟骨細胞24 h 后，倒置顯微鏡下觀察細胞，發現少量漂浮細胞，細胞偽足輕度減少，見圖6A。甲苯胺藍顯示，可見細胞有空泡狀改變，見圖6B。CollagenⅡ免疫熒光染色鑒定結果顯示，紅色熒光顏色明顯變淺，見圖6C。由此可以推斷，經過IL-17 刺激誘導終板軟骨細胞24 h 后，終板軟骨細胞明顯退變衰老，細胞功能下降。

圖6 退變終板軟骨細胞模型的鑒定

3.2.2 含藥血清毒性檢測 與空白對照組相比，含藥血清超過20%的各組細胞活性顯著下降（P＜0.05），具有顯著的細胞毒性，因此，選定最高含藥血清濃度為20%。 詳見圖7。

圖7 不同濃度含藥血清對終板軟骨細胞活性影響

3.2.3 各組終板軟骨細胞活性 與空白對照組相比，經過IL-17 干預造模24 h 的終板軟骨細胞，活性顯著下降（P＜0.05）。與模型對照組相比，加味獨活寄生合劑低、中、高劑量組活性顯著升高（P＜0.05）。 詳見圖8。

圖8 各組終板軟骨細胞活性

3.2.4 各組終板軟骨細胞周期 與空白對照組相比，其余各組的G1 期細胞比例顯著升高（P＜0.05），S期比例顯著降低（P＜0.05），見圖9。與模型組相比，加味獨活寄生合劑低、中、高劑量組G1 細胞比例均顯著降低（P＜0.05），S 期比例顯著升高（P＜0.05），見圖10。

圖9 各組終板軟骨細胞周期

圖10 各組終板軟骨細胞周期比例

3.2.5 各組終板軟骨細胞上清液IL-6 的含量的比較 與空白對照組相比，經過IL-17 干預造模24 h的終板軟骨細胞，IL-6 含量明顯升高（P＜0.05）。 與模型對照組相比，加味獨活寄生合劑低、中、高劑量組IL-6 含量顯著降低（P＜0.05）。 詳見圖11。

圖11 各組終板軟骨細胞上清液IL-6 的含量

3.2.6 各組終板軟骨細胞p-p65、MMP9 mRNA 的相對表達量 與空白對照組相比，經過IL-17 干預造模24 h 的終板軟骨細胞，p-p65、MMP9 mRNA 的相對表達量明顯升高（P＜0.05）。與模型對照組相比，加味獨活寄生合劑低、中、高劑量組p-p65 mRNA的相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。 詳見圖12。

圖12 各組終板軟骨細胞p-p65、MMP9mRNA 的相對表達量

3.2.7 各組終板軟骨細胞p-p65、MMP9 蛋白的表達 與空白對照組相比，模型對照組p-p65、MMP9蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。 與模型對照組相比，加味獨活寄生合劑低、中、高劑量組p-p65、MMP9蛋白表達均降低（P＜0.05）。 詳見表1、圖13—14。

表1 各組軟骨細胞中p-p65、MMP9 蛋白表達量的變化（±s，n=3）

表1 各組軟骨細胞中p-p65、MMP9 蛋白表達量的變化（±s，n=3）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型對照組相比，#P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組加味獨活寄生合劑低劑量組加味獨活寄生合劑中劑量組加味獨活寄生合劑高劑量組F P p-p65/GAPDH 0.49±0.02 0.90±0.02*0.79±0.02*#0.76±0.02*#0.58±0.07*#73.133＜0.05 MMP9/GAPDH 0.71±0.02 0.92±0.01*0.88±0.02*#0.83±0.02*#0.61±0.04*#76.406＜0.05

圖13 各組終板軟骨細胞p-p65 蛋白表達電泳圖

圖14 各組終板軟骨細胞MMP9 蛋白表達電泳圖

4 討論

隨著社會人口老齡化和人們生活方式的改變，LDH 的發病率明顯增加[15]。由于其高致殘率的特點，LDH 給社會和家庭帶來了沉重的負擔[16-17]，因此，對于LDH 的防治有十分重要的意義。本研究旨在通過網絡藥理學和體外實驗研究，探究加味獨活寄生合劑治療LDH 的具體作用機制。本研究運用網絡藥理學方法發現加味獨活寄生合劑治療LDH 具有多成分、多靶點、多通路的特征。 槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山柰酚可能是加味獨活寄生合劑治療LDH的主要活性成分， 而IL-6、JUN、AKT-1、MAPK-8 和MMP9 則是其對應的關鍵靶點。

研究結果提示，加味獨活寄生合劑中含有295種活性成分，其中槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山柰酚是治療LDH 較為重要的活性成分。這4 種成分均屬于黃酮類化合物，是植物為抵御外界脅迫而產生的天然化合物，具有較強的抗氧化、抗炎和抗病毒作用[18]。 槲皮素是一種在安全劑量范圍內天然無毒的類黃酮，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎特性，可以通過抑制氧化應激、減少炎癥反應和恢復線粒體功能障礙來延緩軟骨細胞衰老[19]。 木犀草素抑制H2O2誘導原代鼠軟骨細胞中的細胞死亡、細胞凋亡、氧化應激、程序性壞死和炎癥介質產生[20]。漢黃芩素通過誘導軟骨細胞中AMPKα 磷酸化，抑制鐵死亡，從而保護軟骨細胞[21]。 山柰酚可通過抑制炎癥、氧化應激、破骨細胞自噬和成骨細胞凋亡，同時激活成骨細胞自噬來實現骨骼保護作用[22]。

炎癥的刺激會引起終板軟骨細胞的退變繼而引發椎間盤的突出[4-5]。 IL-17 能夠促進炎癥因子和趨化因子的表達，導致各種炎癥性疾病的發展。 IL-17通過結合異二聚體受體IL-17RA 和IL-17RC，可誘導NF-κB 等轉錄基因的表達，增強下游IL-6、MMP9等細胞因子的表達[23-25]；從而促進炎癥反應的發生，表達一系列炎癥介質，這些介質可以損傷軟骨細胞功能、抑制軟骨細胞增殖并誘導軟骨細胞凋亡，最終造成軟骨細胞代謝失衡以及疾病的發生和發展[26]。IL-6 是白細胞介素家族中的一種具有多重效應的細胞因子，參與調控細胞的生長、分化等各方面。 作為炎癥發生和參與的重要介質，其能夠影響LDH、膝骨性關節炎等骨與關節退行性疾病的發生發展，在腰椎間盤突出組織中存在較高表達[27]。 MMP9 是基質合成和降解的關鍵調節因子，在生理條件下，MMP9 可水解衰老和受損的椎間盤組織，其過度活化會導致椎間盤的退化并引起疼痛[28]。 此外，NF-κB是一種重要的轉錄因子，可調節軟骨細胞增殖和凋亡相關基因的表達[29]。 相關研究表明，IL-17 與軟骨細胞表面的IL-17 受體結合后，可觸發NF-κB p65的磷酸化，進而控制軟骨正常發育和病理破壞[30]。

本研究中，IL-17 干預后的細胞偽足輕度減少，有空泡狀改變，Ⅱ型膠原含量明顯減低，形成了明顯的終板軟骨細胞退變模型。 與空白對照組相比，模型對照組細胞活性顯著下降（P＜0.05），增殖明顯被抑制（P＜0.05），IL-6、p-p65、MMP9 的表達顯著升高（P＜0.05）。通過不同濃度的含藥血清干預后，相比于模型對照組細胞，細胞活性顯著升高（P＜0.05），增殖情況顯著改善（P＜0.05），各組細胞IL-6、p-p65、MMP9的表達明顯降低（P＜0.05）。

綜上所述，加味獨活寄生合劑含藥血清可起到保護終板軟骨細胞退變的作用。 其可能通過調控IL-17/NF-κB 通路，抑制IL-6 以及MMP9 的表達，促進終板軟骨細胞的增殖，從而發揮對LDH 的治療作用。 然而，本研究仍存在不足之處，實驗只驗證了核心通路和對應的核心靶點，實驗未設置陽性藥物對照組。未能完整驗證網絡藥理學提示的其他通路及蛋白；接下來課題組將進行更加深入的動物實驗和細胞實驗，以進一步探究加味獨活寄生合劑治療LDH 的作用機制，為其臨床應用提供更加堅實的理論依據。