基于網絡藥理學分析白龍散治療仔豬腹瀉的機制

郭 翱,顧進華,劉自揚,王學偉,蘇富琴

(中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

仔豬腹瀉是導致仔豬生長受損和仔豬死亡率明顯上升的重要因素,是豬場一直需要解決的難題。仔豬腹瀉一般分為病原性腹瀉和非病原性腹瀉,病原性腹瀉又分為細菌性腹瀉、病毒性腹瀉和寄生蟲性腹瀉,其中細菌性腹瀉為主要原因,產腸毒素大腸桿菌最為常見;非病原性腹瀉一般由飼喂不當或應激反應所致[1］。仔豬發生腹瀉后,部分養殖戶采用抗菌藥進行治療,但抗菌藥的不規范使用導致細菌耐藥,從而使抗菌藥無效。農業農村部發布《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案(2021-2025年)》,號召養殖戶根據養殖管理和防疫實際,科學規范使用抗菌藥,提倡應用獸用中藥、微生態制劑。獸用中藥以多靶點協同作用、不易產生耐藥性、毒副作用小等特點受到廣泛關注。白龍散收載于《中國獸藥典》,由白頭翁、龍膽、黃連3味藥組成,具有清熱燥濕、涼血止痢等功效。毛成榮等[2］、王尚榮等[3］在臨床研究發現,白龍散用于治療仔豬腹瀉的效果顯著,但目前白龍散治療仔豬腹瀉的分子作用機制尚不明確。利用網絡藥理學技術構建多層次網絡模型,從整體角度對中藥進行研究,已成為一種科學解釋中藥有效性和科學性的新策略,在多方面的中藥研究中已具備成功應用的經驗[4］。網絡藥理學是基于系統生物學的理論,融合多向藥理學、生物信息學、計算機科學等多學科的技術和內容,進行“疾病-基因-靶點-藥物”等多層次網絡的構建,探索藥物與疾病間相關性的新學科[5］。本研究采用網絡藥理學方法探究白龍散治療仔豬腹瀉的可能分子作用機制,以期為開展進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 篩選白龍散活性成分及靶標蛋白 利用中藥系統藥理數據庫與分析平臺TCMSP(https:∥tcmspw.com/tcmsp.php)檢索白龍散中各味藥所含的化學成分及其對應的靶標蛋白,并將各味藥分別按照口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18篩選,獲得其活性成分及相對應的靶標蛋白。

1.2 靶標蛋白轉化為靶基因 將獲得的靶標蛋白導入Uniprot數據庫(https:∥www.uniprot.org/),物種選擇為“sus scrofa”,利用VLOOKUP函數將靶標蛋白與靶基因對應,獲得規范的靶基因名稱,所得結果即為活性成分所作用的靶點。

1.3 獲取腹瀉相關靶點 在GeneCards(http:∥www.genecards.org/)和OMIM(https:∥www.omim.org/)數據庫中檢索關鍵詞“diarrhea”,將兩數據庫獲得的結果進行合并,去除重復靶點,從而得到腹瀉相關靶點。

1.4 獲取白龍散作用于仔豬腹瀉的靶點 將白龍散活性成分作用的靶點與腹瀉相關靶點粘貼到Venny2.0.2(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index2.0.2.html)中,制成韋恩圖,其交集結果即為白龍散作用于仔豬腹瀉的關鍵靶點。

1.5 構建白龍散與仔豬腹瀉靶點網絡 將白龍散活性成分和白龍散作用于仔豬腹瀉的靶點導入Cytoscape3.9.1軟件,構建白龍散與仔豬腹瀉靶點網絡。

1.6 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 將白龍散作用于仔豬腹瀉的關鍵靶點導入STRING數據庫(https:∥cn.string-db.org/),選擇Multiple proteins,物種選擇“sus scrofa”,建立PPI網絡并導出TSV文件。將TSV文件導入Cytoscape3.9.1軟件,基于degree大小構建PPI網絡圖。

1.7 GO和KEGG富集分析 將白龍散作用于仔豬腹瀉的關鍵靶點導入DAVID數據庫,選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、物種選擇為“sus scrofa”,進行基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。利用微生信工具(http:∥www.bioinformatics.com.cn/)對富集分析數據進行處理,得到GO富集條形圖和KEGG通路富集分析氣泡圖。

2 結果與分析

2.1 白龍散活性成分篩選 通過TCMSP數據庫,篩選白龍散中符合OB≥30%和DL≥0.18的有效成分35種,其中白頭翁11種、龍膽10種、黃連14種。

2.2 白龍散作用于仔豬腹瀉靶點結果 通過GeneCard和OMIM數據庫收集并刪除重復靶點,獲得腹瀉相關靶點6019個,對白龍散作用靶點與腹瀉相關靶點取交集,得到92個共有靶點,如圖1所示。

圖1 白龍散作用靶點與腹瀉相關靶點交集韋恩圖

2.3 白龍散作用于仔豬腹瀉靶點網絡圖 白龍散作用于仔豬腹瀉的活性成分見表1,將白龍散作用于仔豬腹瀉的活性成分和對應的靶點導入Cytoscape3.9.1軟件構建“白龍散活性成分-靶點”網絡圖,見圖2。該網絡中共有115個節點(活性成分23個、靶點92個),213條相互作用的邊,內圈代表白龍散活性成分、外圈代表這些活性成分作用的靶點、邊代表兩者的相互作用。由圖2可知,槲皮素(MOL000098)、β-谷甾醇(MOL000358)、山奈酚(MOL000422)、小檗堿(MOL001454)與各靶點連接度較高,提示這些活性成分與治療仔豬腹瀉密切相關。

表1 白龍散治療仔豬腹瀉的主要活性成分

圖2 白龍散活性成分-作用于仔豬腹瀉靶點網絡圖

2.4 白龍散活性成分作用于仔豬腹瀉潛在靶點的PPI網路 將白龍散活性成分作用于仔豬腹瀉的92個靶點導入STRING數據庫,獲得PPI網絡并導出TSV文件,將TSV文件導入Cytoscape3.9.1軟件,按照Degree值從大到小排序,取排序前二十的靶點構建關鍵靶點網絡圖如圖3。在圖3中,節點表示靶點,節點越大,度值越大,說明該靶點在網絡中的作用越重要。由圖3可知,TNF、MAPK14、VEGFA、IL16、CASP3等在網絡中發揮的作用較大,提示它們可能為白龍散治療仔豬腹瀉的關鍵靶點。

2.5 GO功能富集分析 將白龍散活性成分作用于仔豬腹瀉的92個靶點輸入DAVID數據庫,設定P<0.05進行GO分析。GO分析分為生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cellular component,CC)3個部分,共同描述基因產物的功能[6］。GO功能富集分析得到GO條目233個,其中生物過程(biological process,BP)181個條目,細胞組分(cellular component,CC)13個條目,分子功能(molecular function,MF)39個條目。根據P值從小到大排序,選擇前15條GO條目,利用微生信工具繪制GO富集分析見圖4。圖4顯示,生物過程主要涉及對糖皮質激素的反應、免疫球蛋白產生的正向調節、免疫應答中細胞因子產生的負向調控、慢性炎癥反應對抗原刺激的負調節等;細胞組分主要涉及細胞外間隙、細胞外等;分子功能主要涉及細胞因子活性、蛋白二聚化活性等。

圖4 GO富集分析圖

2.6 KEGG通路富集分析 將白龍散作用于仔豬腹瀉的92個靶點導入輸入DAVID數據庫,設定P<0.05進行KEGG通路分析,得到123個富集通路條目,根據P值從小到大排序,選擇前15條KEGG條目,利用微生信工具繪制KEGG富集分析,如圖5所示。主要通路有癌癥相關通路、IL-17信號通路等。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討 論

中藥成分多而復雜,采用網絡藥理學的研究方法來預測中藥活性成分、作用靶點,可以為探索中藥治療疾病的作用機制、新藥研發和發現新的適應證提供思路[7］。王佳俊等[8］采用網絡藥理學探索黃連厚樸湯改善潰瘍性結腸炎的主要活性成分及作用機制并在動物實驗上進行驗證,結果表明黃連厚樸湯能通過調節ROS表達、降低細胞凋亡、抑制炎癥反應等生物學過程發揮作用。程彬峰等[9］采用網絡藥理學分析方法并結合豚鼠哮喘模型和人支氣管上皮細胞炎癥模型,揭示了清肺消炎丸抗炎作用的多維調控網絡。李紹強等[10］采用網絡藥理學探究黃連解毒湯治療銀屑病的活性成分、作用靶點及信號通路,為臨床使用和新藥研發提供參考。

仔豬因免疫系統、消化系統發育不完善,易受到各種病原微生物的侵襲,再加上各種應激因素的影響,容易出現腹瀉等癥狀。隨著對中藥的深入研究,發現中藥通過多種成分,作用于多靶點、多通路在治療感染性和應激性腹瀉均具有獨特功效。同時,中藥資源豐富,具有毒副作用小、不易產生耐藥性等優勢。在獸醫臨床應用中,中藥復方制劑“白頭翁散”、“黃連解毒湯”、“止痢散”、“白龍散”等用于治療仔豬腹瀉的效果顯著,但治療仔豬腹瀉的作用機制尚不清晰。本研究通過網絡藥理學對白龍散治療仔豬腹瀉的主要活性成分、作用靶點進行探索。通過網路藥理學初步篩選白龍散治療仔豬腹瀉的主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、小檗堿等。槲皮素是一種持久的抗炎物質,具有很強的抗炎能力[11］。梅華迪等[12］研究表明,在飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可降低仔豬腹瀉發生率。多項研究表明,β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、抑菌和免疫調節等多種生物活性[13］。Yuhang Jin等[14］研究發現,山奈酚能夠降低豬腸上皮細胞氧化損傷和凋亡。李春林等[15］研究發現,小檗堿可有效的抑制LPS誘導的豬腸道上皮細胞的炎性反應,其機制與抑制豬腸道上皮細胞的促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達,抑制LPS激活的NF-κB/MAPK信號通路的關鍵蛋白的磷酸化和表達等有關。以上研究表明,白龍散中4種活性成分均具有抗炎活性,可能是其藥效物質基礎的重要組成部分。

PPI分析結果顯示,TNF、MAPK14、VEGFA、IL16、CASP3等靶點可能與仔豬腹瀉密切相關。TNF是一種具有多種生物學效應的細胞因子,它通過與細胞膜上的特異性受體結合,促進細胞生長、分化、凋亡和誘導炎癥[16］。MAPK14作為MAPK家族中的重要成員之一,其表達異?？芍聶C體生理功能紊亂,引發機體免疫功能失調,導致許多疾病的發生,與炎癥反應密切相關[17］。VEGFA在控制細胞生存、生長、分化、粘附、遷移、腫瘤血管生成、傷口愈合和組織修復等方面發揮重要作用[18］。VEGFA可以促進腸細胞遷移和腸道上皮細胞損傷修復[19］。IL-6是一種重要的前促炎癥性細胞因子,可通過與下游受體結合形成多種復合物,誘導下游轉錄因子的表達,參與調節腸道免疫應答[20］。CASP3在細胞凋亡的執行階段起著重要作用,參與細胞凋亡、壞死和炎癥的信號轉導,負責凋亡執行的胱天蛋白酶的激活級聯反應,誘導細胞發生凋亡[21］。以上分析結果表明,白龍散的活性成分可能通過作用于TNF、MAPK14、VEGFA、IL16、CASP3等靶點來調控炎癥反應、免疫應答和腸道上皮細胞修復來發揮作用。

GO分析結果顯示,白龍散通過免疫球蛋白產生的正向調節、免疫應答中細胞因子產生的負向調控、慢性炎癥反應對抗原刺激的負調節等過程發揮治療作用。KEGG通路富集結果顯示,白龍散主要通過調控IL-17信號通路。IL-17是一個重要的促炎癥細胞因子,IL-17在多種炎癥反應和自身免疫性疾病的發病機制中起關鍵作用,IL-17信號通路調控異常導致機體炎癥反應和自身免疫病的發生[22］。因此,白龍散的活性成分可能通過調控炎癥信號通路、免疫應答發揮治療仔豬腹瀉的作用。

綜上所述,白龍散治療仔豬腹瀉機制與槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、小檗堿等活性成分作用于TNF、MAPK14、VEGFA、IL16、CASP3等關鍵靶點,調控IL-17等信號通路來調控炎癥反應和免疫應答密切相關。同時,通過網絡藥理學分析可以較好地闡述白龍散通過多成分、多靶點、多通路來治療仔豬腹瀉。