速溶黃大茶輔助降血糖功能及機(jī)制研究

李 睿,馬 征,李心偉,朱 玉,王一君,羅勝勇*

(1.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,安徽 合肥 230061;2.安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,安徽 合肥 230601; 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230061)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一種由多種病因引起的,以體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)紊亂為特征的代謝性疾病[1],其病因主要牽涉機(jī)體胰島功能的減退及靶組織對(duì)胰島素敏感性的降低。而長期的高血糖則會(huì)引起多種并發(fā)癥,如視網(wǎng)膜病變、腎病以及神經(jīng)病變等,且病程無法逆轉(zhuǎn)[2]。目前,根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn),將糖尿病分為四型,分別為Ⅰ型、Ⅱ型、妊娠期及其他特殊類糖尿病。其中Ⅱ型糖尿病為主要的發(fā)病類型,發(fā)病人數(shù)占我國糖尿病總發(fā)病人數(shù)的95%左右[3]。目前臨床對(duì)于Ⅱ型糖尿病的治療仍以口服化學(xué)性藥物及注射胰島素為主,但化學(xué)性藥物普遍存在安全劑量范圍小、毒副反應(yīng)大等不良作用[4],因此尋找一種天然化合物替代化學(xué)性藥物已成為當(dāng)今預(yù)防和治療糖尿病發(fā)生的一種新思路。

大葉黃茶(Large-leaf yellow tea,LYT)是中國茶葉中的一種特色類型,產(chǎn)自安徽省霍山縣,由成熟的葉和莖沖泡而成。已有研究發(fā)現(xiàn),與綠茶或紅茶等其他茶相比,LYT在調(diào)節(jié)血糖方面具有明顯優(yōu)勢[5,6]。速溶黃大茶(Instant Huangda tea,IHT)是利用大葉黃茶進(jìn)行深加工制成的一類保健食品,其口味及便捷性更加符合目前大眾的健康飲食需求。為了明確速溶黃大茶的輔助降血糖作用,本研究擬借助地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗糖脂代謝紊亂模型,初步探討速溶黃大茶的降血糖作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SD雄性大鼠80只,體質(zhì)量(150±20)g,由南通大學(xué)提供,合格證號(hào):20200906,飼養(yǎng)于安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院屏障實(shí)驗(yàn)室內(nèi)(許可證號(hào):SCXK(皖)2019-008),溫度18～24℃,相對(duì)濕度40% ～70%,實(shí)驗(yàn)期間各組動(dòng)物按試驗(yàn)方案攝食飲水。

1.1.2 試劑與儀器 速溶黃大茶(IHT),黃色粉末,由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(批號(hào):20181115,規(guī)格:2.5g/袋,人用量為1袋/d,實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配成0.42g/mL母液);醋酸地塞米松注射液(批號(hào):20190912),購于上海通用藥業(yè)股份有限公司;標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)鼠糧、高熱能鼠飼料(規(guī)格:25kg/袋),購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司;大鼠胰島素(Ins)ELISA試劑盒,購于深圳子科生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(酶活力為14.72U/mg),購于美國Sigma公司;阿卡波糖(批號(hào):20200115)、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG,批號(hào):20191004),購于北京索萊寶科技有限公司。茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):DSTDC013001)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):DSTDB003601),均購于成都德思特生物技術(shù)有限公司。DS-3型血糖儀,購于翔國科技有限公司;DS-671電子秤,購于上海寺岡電子有限公司;IMARK酶標(biāo)儀,購于bio-rad公司;7020生化分析儀,購于日本日立公司;LC-20AT高效液相色譜儀,購于日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC測定IHT中EGCG及茶多酚的含量 稱取0.2077g IHT溶于甲醇定容至10mL,超聲30vmin后,0.45μm濾器過濾,取其中1mL溶液加入甲醇,定容至5mL(稀釋5倍);稱取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品2.659mg,溶于甲醇定容至10mL;稱取EGCG標(biāo)準(zhǔn)品0.495mg,溶于甲醇定容至10mL;分別進(jìn)樣,測定其高效液相色譜。

1.2.2 速溶黃大茶劑量選擇及給予方式 IHT人體推薦量為2.5g/d,即42mg/kg。采用大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以人體推薦量的2.5、5、10倍劑量作為相應(yīng)劑量,分為105mg/kg、210mg/kg、420mg/kg共3個(gè)劑量組。用蒸餾水將IHT溶解成1.05g/100mL、2.1g/100mL、4.2g/100mL共3個(gè)濃度。灌胃給予相應(yīng)濃度IHT,灌胃容積1mL/100g。

1.2.3 對(duì)正常大鼠空腹血糖的影響 選取SD大鼠30只,隨機(jī)分為對(duì)照組和IHT組兩個(gè)劑量組,每組15只。受試樣品組給予高濃度(4.2g/100mL)IHT,對(duì)照組給予同體積溶劑(蒸餾水)。連續(xù)給30d后,禁食4h測空腹血糖值,比較兩組空腹血糖值。

1.2.4 模型建立及給予受試樣品 選取SD大鼠50只,普通維持料適應(yīng)飼養(yǎng)3d后,禁食4h,測定空腹血糖值(0h),之后灌胃給予2.5g/kg BW葡萄糖并測定0.5、2h血糖值。以所測值將大鼠分為5組,每組10只,分別為空白對(duì)照組、模型組、IHT3個(gè)劑量組。3個(gè)劑量組灌胃給予相應(yīng)濃度IHT,空白對(duì)照組不進(jìn)行處理,模型對(duì)照組給予同等體積溶劑,連續(xù)35d。其中第1周各組給予維持料飼養(yǎng),1周后模型對(duì)照組和3個(gè)劑量組更換高脂飼料進(jìn)行飼喂,2周后模型對(duì)照組和3個(gè)劑量組在高脂飼料基礎(chǔ)上,分別給予0.8mg/kg BW地塞米松腹腔注射,1次/d,連續(xù)14d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束,各組動(dòng)物禁食4h,之后按相應(yīng)指標(biāo)檢測。實(shí)驗(yàn)流程,見圖1A。

圖1 EGCG的HPLC

1.2.5 測定給樣后空腹血糖 各組動(dòng)物禁食4h后,尾部取血,用血糖儀測定血糖值,即為空腹血糖值,比較各組大鼠血糖值及血糖下降的百分率。計(jì)算公式:

1.2.6 給樣后糖耐量測定 以空腹血糖值作為給葡萄糖前(0h)血糖值,IHT組給予不同濃度IHT,模型對(duì)照組給予同體積溶劑,空白對(duì)照組不做處理,20min后各組經(jīng)口給予葡萄糖2.5g/kg BW,測定給葡萄糖后各組0.5、2h的血糖值,若模型對(duì)照組0.5h血糖值≥10mmol/L,或模型對(duì)照組0.5、2h任一時(shí)間點(diǎn)血糖升高或血糖曲線下面積升高,與空白對(duì)照組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則判定糖代謝紊亂模型成立,在此基礎(chǔ)上,觀察模型對(duì)照組與IHT組空腹血糖、給葡萄糖后(0.5、2h)血糖及0、0.5、2h血糖曲線下面積的變化。計(jì)算公式:

1.2.7 給樣后血清中膽固醇、甘油三酯含量測定 各組動(dòng)物禁食4h,采用7020生化分析儀檢測血清中膽固醇、甘油三酯含量。

1.2.8 給樣后胰島素抵抗指數(shù)測定 各組動(dòng)物禁食4h,ELISA法檢測血清胰島素,按下式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù):

1.2.9 α-葡萄糖苷酶活性測定 取40μL α-葡萄糖苷酶液(0.04U/mL)和40μL IHT于試管中,其中IHT高、中、低劑量組的濃度分別為4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL,將混合物于37℃水浴5min,之后加入20μL PNPG底物溶液(0.5mmol/L),37℃水浴30min,繼續(xù)加入50μL Na2CO3溶液(0.2mol/L)終止反應(yīng),室溫5min,采用酶標(biāo)儀于405nm 處測定吸光度值A(chǔ)(檢測結(jié)果,見表1)。此外,另設(shè)阿卡波糖(1mg/mL)作為陽性對(duì)照組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,按照下式計(jì)算抑制率:

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)反應(yīng)體系 (μL)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 IHT中EGCG及茶多酚含量

結(jié)果如圖1、圖3所示,EGCG的保留時(shí)間為17.834min,峰面積為688 318;IHT中EGCG保留時(shí)間為17.799min,峰面積為3 483 238;通過計(jì)算得IHT中EGCG的含量為30.23mg/g。此外根據(jù)圖2所示,茶多酚中EGCG的保留時(shí)間為17.811min,峰面積為2 058 964,計(jì)算可得茶多酚中EGCG的含量為556.86mg/g,由此推算IHT中茶多酚含量約為5.43%。

圖2 茶多酚的HPLC

圖3 IHT的HPLC

2.2 對(duì)正常大鼠空腹血糖的影響

灌胃給予IHT 35d后,與空白對(duì)照組相比,IHT高劑量組大鼠空腹血糖無明顯差異,可判定IHT對(duì)正常大鼠血糖無影響,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2。

表2 對(duì)正常大鼠空腹血糖影響

2.3 對(duì)地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠體質(zhì)量的影響

與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠在給予地塞米松之后體質(zhì)量呈逐漸下降趨勢;與模型組比較,IHT 3個(gè)劑量組均能有效逆轉(zhuǎn)模型組大鼠體質(zhì)量下降趨勢。見圖4。

圖4 IHT對(duì)模型大鼠體質(zhì)量的影響

2.4 對(duì)地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠空腹血糖的影響

與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠空腹血糖及血糖下降率無明顯改變(P>0.05);與模型對(duì)照組比較,IHT 3個(gè)劑量組大鼠空腹血糖及血糖下降率也無明顯改變(P>0.05)。見表3。

表3 IHT對(duì)模型大鼠空腹血糖的影響

2.5 對(duì)地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠糖耐量的影響

各組大鼠經(jīng)灌胃給予葡萄糖后,模型組大鼠0.5h血糖值(13.49mmol/L)≥10mmol/L,且與空白對(duì)照組比較,血糖下曲線面積明顯升高(P<0.01),可判定糖代謝紊亂模型成立。與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血糖在0.5、2h升高(P<0.05),血糖曲線下面積明顯升高(P<0.01);而與模型組比較,IHT3個(gè)劑量組0.5、2h血糖明顯下降,曲線下面積明顯下降(P<0.01)。見表4。

表4 IHT對(duì)模型大鼠糖耐量的影響

2.6 對(duì)地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠血清膽固醇、甘油三酯的影響

與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清總膽固醇、甘油三酯明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較,IHT高、中劑量組血清總膽固醇含量降低(P<0.05),甘油三酯無明顯變化(P>0.05);IHT低劑量組血清總膽固醇及甘油三酯含量均無明顯改變(P>0.05)。見表5。

表5 IHT對(duì)模型大鼠總膽固醇、甘油三酯的影響

2.7 對(duì)地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠血清胰島素抵抗指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清胰島素水平明顯升高,胰島素抵抗指數(shù)升高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較,IHT高、中劑量組血清胰島素水平降低(P<0.05),胰島素抵抗指數(shù)下降(P<0.05);IHT低劑量組可減少血清胰島素水平(P<0.01),而對(duì)胰島素抵抗指數(shù)無明顯影響(P>0.05)。見表6。

表6 IHT對(duì)模型大鼠胰島素抵抗指數(shù)的影響

2.8 對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

IHT 3個(gè)劑量組均能對(duì)α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用(對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率均>50%)。IHT高劑量組與IHT中劑量組對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別為(62.74±4.17)%以及(61.58±5.93)%,與阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率(60.22±3.56)%,無明顯差異(P> 0.05);而IHT低劑量組對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為(54.41±4.04)%,與阿卡波糖相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖5。

注:與阿卡波糖組比較,*P<0.05。

3 結(jié)語

Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是糖尿病中較為常見的一種類型,其臨床特征表現(xiàn)為血漿葡萄糖異常升高,其發(fā)生機(jī)制主要與胰島β細(xì)胞功能障礙和不同程度的胰島素抵抗引起的糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝紊亂有關(guān)[7-8],而IHT研究主要針對(duì)調(diào)控Ⅱ型糖尿病。因此,根據(jù)以上T2DM的特征,本研究選用了高脂飼料誘導(dǎo)(4周)聯(lián)合低劑量地塞米松注射(14d)的方法建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型[9],結(jié)果顯示,造模后與正常對(duì)照組大鼠比較,模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低,血清中總膽固醇、甘油三酯含量明顯升高,同時(shí)伴隨胰島素抵抗指數(shù)增加,此外,模型組大鼠0.5、2h血糖值和血糖曲線下面積均高于正常對(duì)照組大鼠,提示大鼠胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型建立成功,能夠模擬Ⅱ型糖尿病模型,可為后續(xù)藥物干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前,臨床上治療T2DM的藥物主要包括胰島素及一些口服性降血糖藥物,包括磺脲、雙胍和糖苷酶抑制劑等,但此類藥物在臨床應(yīng)用時(shí)存在較多副作用,包括胃腸功能障礙、體質(zhì)量增加、低血糖和胰島素抵抗[10],因此,尋找一些毒性和副作用較小的天然產(chǎn)物替代化學(xué)性藥物治療發(fā)病初期的血糖異常患者有著重要的意義。IHT是一種具有保健作用的食品,茶多酚中的EGCG是其主要組成成分之一。已有研究表明,TP中的EGCG有顯著的降低血糖作用[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組比較,IHT能夠明顯降低大鼠給予葡萄糖后0.5h及2h的血糖值,且曲線下面積也明顯下降,提示IHT能夠升高模型組大鼠的糖耐量指標(biāo)。此外,IHT能夠明顯降低血清中總膽固醇含量及胰島素抵抗指數(shù),但是對(duì)模型大鼠空腹血糖無明顯作用。因此可推測IHT的輔助降血糖作用主要與調(diào)控餐后血糖水平有關(guān)。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是糖苷水解酶大家族中的一類,其在生物體內(nèi)分布廣泛,主要參與生物體內(nèi)的食物代謝、多糖和糖蛋白的合成等[13]。當(dāng)機(jī)體攝入食物(淀粉)后,唾液淀粉酶能將多糖消化成寡糖,而α-葡萄糖苷酶則能將進(jìn)入小腸的寡糖分解為單個(gè)葡萄糖,并為小腸吸收,升高餐后血糖水平[14]。因此可以通過抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性,延緩或降低葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收,調(diào)整機(jī)體血糖的水平,改善Ⅱ型糖尿病患者的臨床癥狀[15]。此外有文獻(xiàn)報(bào)道,EGCG能夠顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性[16],本研究也發(fā)現(xiàn)IHT3個(gè)劑量組均能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性(抑制率>50%),且與陽性藥物阿卡波糖相比,IHT高、中劑量組對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率無明顯差異,提示我們IHT對(duì)地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠輔助降血糖作用與抑制α-葡萄糖苷酶活性有關(guān)。

綜上所述,IHT作為一種新型保健食品,具有明確的輔助降血糖作用,并具備對(duì)Ⅱ型糖尿病預(yù)防和治療的潛力,而其作用機(jī)制主要與抑制α-葡萄糖苷酶活性有關(guān)。