蟲草扶正方協同免疫調節作用研究

蔣均才,康小燕,陳 坤,武萬興,汪小東,李 潤*,梅全喜

(1.宜昌東陽光長江藥業股份有限公司,湖北 宜昌 443300;2.東莞市東陽光冬蟲夏草 研發有限公司,廣東 東莞 523000;3.深圳市寶安區中醫院,廣東 深圳 518000)

《素問·刺法論》提出“正氣存內,邪不可干”,如果體內正氣充沛,外界致病之邪氣就不能侵襲機體。正氣是人體內部各個系統協調運作、維持身體平衡穩定狀態的基礎。免疫力則是現代醫學的概念,是機體對外界病原體、抗原等異物的識別和排除反應的能力,是人體自身防御機制的一種重要表現。在概念和功能上,中醫的“正氣”理論與免疫有很多相似之處,正氣和免疫力都是機體正常生理功能,共同發揮防御、自穩、監視作用。因此,增強正氣,或者增強機體的免疫力,提高機體自我調節能力,以預防疾患發生,維護身心健康[1]。

蟲草扶正方由冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂組成,具有扶正固本,增強機體免疫力,調整機體亞健康狀態的作用。方中冬蟲夏草與西洋參、北沙參同用,具有補肺益腎、益氣養陰的功效,稍佐以肉桂鼓舞正氣,增強冬蟲夏草培補下元的作用。全方性味平和,陰陽雙補,可調和肺、腎等臟腑功能,提高免疫力,增強身體機能。現代研究表明,冬蟲夏草、西洋參、北沙參能增強機體免疫功能[2-11],但三者配伍增強免疫力的研究尚未見報道。為此,參考國家市場監督管理總局《保健食品功能評價方法(2020年版)(征求意見稿)》,對以冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂為原料配伍的蟲草扶正方進行免疫力功能試驗研究,探討其機制,為后續產品的開發及臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性Balb/c小鼠,體質量18～22g,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(湘)2019-0004,實驗動物使用許可證號:SYXK(湘)2015-0016,檢疫合格。

1.2 藥品與試劑

蟲草扶正方組成:冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂,采用已上市HEC牌冬蟲夏草經典復方膠囊,由東莞市東陽光冬蟲夏草研發有限公司提供(批號:H0408BU),冬蟲夏草粉(批號:BJ20190117)由東莞市東陽光冬蟲夏草研發有限公司提供,肉桂(批號:XC20190215)由西安小草植物科技有限責任公司提供,北沙參(批號:DJC13)和西洋參(批號:DED30)由順天本草股份有限公司提供,藥材均符合《中華人民共和國藥典》(2020年版)標準[12]。

刀豆蛋白A(批號:C5272-0019)購自Sigma;噻唑藍(批號:190213)購自上海源葉生物科技有限公司;0.9%氯化鈉注射液(批號:A19021103)購自湖南康源制藥有限公司;SA緩沖液(批號:S31106)購自北京雷根生物技術有限公司;都氏液(批號:D190417)購自路非凡生物科技有限公司;綿羊血紅細胞SRBC(批號:YC-X00106)購自鄭州百基生物技術有限公司;CCK-8試劑盒(批號:FK774)購自日本同仁化學;LDH試劑盒(批號:GL19302)購自東仁化學;印度墨汁(批號:P0544-0012)購自廣州市齊云生物技術有限公司。

1.3 儀器設備

HERAcell?150i型細胞培養箱(美國Thermo Fisher公司);ST16型離心機(美國Thermo Fisher公司);DJB系列不銹鋼流架(蘇州市蘇杭科技器材有限公司);SW-CJ型超凈操作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);PHERAstarFS型酶標儀(德國BMG LABTECH GMbH公司);ME403E/02型梅特勒天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法

2.1 試驗動物分組及給藥方法

2.1.1 蟲草扶正方拆方協同免疫調節作用 本實驗采用正常小鼠,按照體質量隨機分為正常對照組、蟲草扶正方組、冬蟲夏草+北沙參+肉桂組、冬蟲夏草+西洋參+肉桂組、冬蟲夏草+西洋參+北沙參組、西洋參+北沙參+肉桂組、冬蟲夏草組、西洋參組、北沙參組、肉桂組共10組,每組各10只小鼠。各組小鼠用帶有灌胃針頭的注射器經口灌胃給藥,按照體質量計算給藥體積,給藥體積為10mL/kg。給藥劑量如表1所示,正常對照組給予等體積蒸餾水,每天給藥1次,連續給藥30天。

表1 動物分組及給藥劑量

供試樣品按照表2中的比例(質量百分比)進行稱量,經粉碎,過80目篩,混合,樣品稱取適量后分別加入相應體積的蒸餾水超聲溶解,配置濃度為30mg/mL。

表2 各試驗組分組及原料占比情況 (%)

2.1.2 蟲草扶正方不同劑量免疫調節作用 本實驗采用正常小鼠,按照體質量隨機分為正常對照組、蟲草扶正方100mg/kg組、蟲草扶正方200mg/kg組、蟲草扶正方300mg/kg組、蟲草扶正方400mg/kg組,共5組,每組各10只小鼠。4組蟲草扶正方的給藥劑量分別相當于人體推薦量的10倍、20倍、30倍、40倍。各組小鼠用帶有灌胃針頭的注射器經口灌胃給藥,按照體質量計算給藥體積,給藥體積為10mL/kg。正常對照組給予等體積蒸餾水,每天給藥1次,連續給藥30天。

2.2 ConA誘導脾淋巴細胞增殖檢測

灌胃給予供試品30天后,用頸椎脫臼法處死小鼠,取脾臟并使用RPMI1640培養基制備單細胞懸液,每一份脾細胞懸液分2孔加入96孔培養板中,每孔100μL。一孔加10μg/mL的刀豆蛋白A液(ConA液)10μL,另一孔加入等量PBS作為對照。置于37℃、5% CO2培養箱中培養48h。培養結束后,每孔加CCK8液,再繼續培養4h后進行檢測。每孔做3個平行孔,用酶標儀在570nm波長處測定OD值。脾淋巴細胞的增殖能力用ConA的OD值減去不加ConA的OD值表示。供試樣品組的OD差值顯著高于對照組的OD值,可判定該項實驗結果陽性。

2.3 小鼠碳廓清能力檢測

連續灌胃給予供試品30天后,通過尾靜脈注射生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁,注射量按10mL/kg體質量計算。在注射后2min、10min從內眥靜脈叢取血20μL,加入到2mL 0.1 % Na2CO3溶液中,用酶標儀在600nm波長處測定OD值,并將小鼠處死,取肝臟、脾臟稱質量,計算吞噬指數,以表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數a,受試樣品的吞噬指數顯著高于對照組的吞噬指數,可判定該項實驗結果陽性。

2.4 NK細胞活性測定

灌胃給予供試品30天后,用頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠脾臟制備單細胞懸液,按乳酸脫氫酶測定法進行實驗,用酶標儀在490nm處測定OD值,計算NK細胞活性。按下式計算NK細胞活性,供試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性,即可判定該項實驗結果陽性。

NK細胞活性(%)=

2.5 血清溶血素試驗

各組小鼠按10mL/kg灌胃給予相應供試樣品或蒸餾水,1次/天,連續30天。實驗結束前第5天,每只小鼠腹腔注射0.2mL 2%(v/v)SRBC進行免疫。末次給樣1h后,摘眼球取血,收集血清用0.9%氯化鈉注射液稀釋,收集血清用0.9%氯化鈉注射液稀釋,按標準規定檢測半數溶血值(HC50)。供試樣品各劑量組與正常對照組進行比較,供試樣品組的HC50顯著高于對照組,可判定該項實驗結果陽性。

2.6 統計學分析

3 結果與分析

3.1 蟲草扶正方拆方協同免疫調節作用

3.1.1 對小鼠體質量的影響 實驗過程中,所有小鼠活動良好,皮毛光滑,飲食和飲水正常,無精神不振情況,蟲草扶正方組及各不同配伍組與正常對照組的比較,小鼠的體質量差異無統計學意義(P>0.05),見表3所示。

表3 各組受試物對小鼠體質量的影響

3.1.2 小鼠脾淋巴細胞轉化試驗 如表4所示,與正常對照組相比,蟲草扶正方組、冬蟲夏草+北沙參+肉桂組及冬蟲夏草+西洋參+北沙參組小鼠的脾淋巴細胞增殖活性在ConA誘導下顯著增加(P<0.01),而其他組小鼠的脾淋巴細胞增殖活性無明顯變化,差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 蟲草扶正方及不同配伍對小鼠免疫功能的影響

3.1.3 小鼠碳廓清能力試驗 如表4所示,與正常對照組相比,蟲草扶正方組小鼠的巨噬細胞吞噬指數顯著升高(P<0.01),冬蟲夏草+西洋參+北沙參組及冬蟲夏草組小鼠的巨噬細胞吞噬指數顯著升高(P<0.05),而其他組別小鼠的吞噬指數無明顯變化,差異無統計學意義(P>0.05)。

3.1.4 NK細胞活性測定 如表4所示,與正常對照組相比,蟲草扶正方組、冬蟲夏草+西洋參+北沙參組及冬蟲夏草組小鼠的NK細胞殺傷活性顯著增加(P<0.01),而其他組小鼠的NK細胞較正常對照組相比無顯著變化,差異無統計學意義(P>0.05)。

表4的實驗結果表明,與正常對照組相比,蟲草扶正方組(冬蟲夏草+西洋參+北沙參+肉桂)、冬蟲夏草+西洋參+北沙參組小鼠的脾淋巴細胞ConA誘導下增殖能力、巨噬細胞吞噬功能及NK細胞殺傷活性均顯著增強(P<0.01或P<0.05),冬蟲夏草組小鼠的巨噬細胞吞噬功能及NK細胞殺傷活性均顯著增強(P<0.01或P<0.05)。根據《保健食品功能評價方法(2020年版)(征求意見稿)》中增強免疫力指導原則,這3組受試樣品均具有增強免疫力作用,其中,蟲草扶正方組的效果要優于冬蟲夏草+西洋參+北沙參組,冬蟲夏草+西洋參+北沙參組的效果優于冬蟲夏草組。與正常對照組相比,冬蟲夏草+北沙參+肉桂組小鼠的脾淋巴細胞ConA誘導下增殖能力顯著增強(P<0.01),巨噬細胞吞噬指數及NK細胞活性均無明顯變化。與正常對照組相比,其他5組小鼠的脾淋巴細胞增殖能力、巨噬細胞吞噬指數及NK細胞活性均無明顯變化。

3.2 蟲草扶正方不同劑量免疫調節作用

3.2.1 對小鼠體質量的影響 實驗過程中,所有小鼠活動良好,皮毛光滑,飲食和飲水正常,無精神不振情況,蟲草扶正方組及各對比例組小鼠的體質量與正常對照組的比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表5所示。

表5 各組受試物對小鼠體質量的影響

3.2.2 小鼠脾淋巴細胞轉化試驗 當淋巴細胞受ConA刺激后淋巴母細胞發生增殖反應,淋巴細胞數目增加。CCK8檢測ConA刺激后淋巴細胞增殖細胞數量即可反映出淋巴細胞受抗原刺激后機體的免疫力強弱。如表6所示,與正常對照組相比,蟲草扶正方1組小鼠的脾淋巴細胞增殖能力增強(P<0.05),蟲草扶正方2組、3組和4組小鼠的脾淋巴細胞增殖能力顯著增強(P<0.01),判定蟲草扶正方各劑量組實驗結果均為陽性。

表6 蟲草扶正方各劑量組對小鼠免疫功能的影響

3.2.3 小鼠碳廓清能力試驗 巨噬細胞的吞噬功能是衡量機體非特異性免疫功能的一項重要指標,當小鼠尾靜脈注射墨汁后,外周血中的巨噬細胞會吞噬異物顆粒,檢測巨噬細胞的吞噬指數a的大小能夠反映出機體巨噬細胞吞噬功能的高低。如表6所示,與正常對照組相比,蟲草扶正方2組和蟲草扶正方4組小鼠的吞噬指數顯著升高(P<0.05),蟲草扶正方3組小鼠的單核-巨噬細胞吞噬指數顯著升高(P<0.01),而蟲草扶正方1組單核-巨噬細胞吞噬能力與正常對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05),判定蟲草扶正方2組、3組、4組實驗結果為陽性,蟲草扶正方1組實驗結果為陰性。

3.2.4 NK細胞活性測定 NK細胞是一類具有殺傷作用的天然免疫細胞群,NK細胞殺傷活性是機體非特異性免疫功能的一項重要指標。NK細胞與靶細胞共同培養條件下,靶細胞被NK細胞殺傷,并釋放出LDH(乳酸脫氫酶)到細胞外。因此用LDH細胞毒試劑盒檢測LDH釋放量即可反映出NK細胞的殺傷活性,進而反應機體免疫功能。如表6所示,與正常對照組相比蟲草扶正方3組NK細胞殺傷活性極顯著增強(P<0.01),而蟲草扶正方1組、2組和4組NK細胞殺傷活性與正常對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05),判定蟲草扶正方3組實驗結果為陽性,蟲草扶正方1組、2組和4組實驗結果為陰性。

3.2.5 血清溶血素試驗 用綿羊紅細胞免疫小鼠,可引發小鼠血清中的特異性抗綿羊紅細胞抗體的產生,該抗體是一種溶血素,能夠溶解綿羊紅細胞。如表6所示,與正常對照組相比,蟲草扶正方各劑量組半數溶血值無顯著性差異(P>0.05)。

蟲草扶正方由冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂組成,本試驗從細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性等方面研究蟲草扶正方的免疫調節功能。根據《保健食品功能評價方法(2020年版)(征求意見稿)》中增強免疫力指導原則,在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面中任兩個方面結果陽性,可判定該受試樣品具有增強免疫力功能作用。表6實驗結果顯示,與正常對照組相比,蟲草扶正方劑量2組、3組、4組均具有增強機體免疫力的功能,其中最低有效作用劑量為200mg/kg。

4 結果與討論

研究結果表明,組成蟲草扶正方的各味藥材間(冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂)存在免疫協同作用,在同等劑量條件下復方的免疫協調作用明顯優于單味藥材或部分藥材組合;且蟲草扶正方在不同劑量條件下(200、300、400mg/kg)具有脾淋巴細胞轉化活性、NK細胞殺傷活性和巨噬細胞吞噬活性,根據《保健食品功能評價方法(2020年版)(征求意見稿)》評價標準判定:蟲草扶正方具有增強免疫力的作用。

據文獻報道,冬蟲夏草、西洋參及北沙參具有增強免疫力的功能[2-11],其中冬蟲夏草增強免疫力的最低有效作用劑量為200mg/kg[13],西洋參增強免疫力的最低有效作用劑量為550mg/kg[14-15],北沙參增強免疫力的最低有效作用劑量為2 000mg/kg[16],而肉桂未見有增強免疫力方面的報道。蟲草扶正方不同劑量實驗中,蟲草扶正方增強免疫力的最低有效作用劑量為200mg/kg,整體配方最低有效作用劑量遠遠低于文獻報道中西洋參及北沙參等單味藥材的最低有效作用劑量,說明蟲草扶正方各味藥材具有協同免疫的作用。

在蟲草扶正方拆方配伍協同作用試驗中,同等劑量(300mg/kg)條件下,與正常對照組相比,冬蟲夏草組具有增強免疫力的作用,冬蟲夏草組的試驗結果與文獻報道吻合,西洋參及北沙參組由于供試樣品劑量未達到最低起效劑量,故未體現出提高免疫力的效果。與正常對照組相比,冬蟲夏草+西洋參+北沙參組具有明顯的增強免疫力的作用,冬蟲夏草+北沙參+肉桂組、冬蟲夏草+西洋參+肉桂組及西洋參+北沙參+肉桂組未體現增強免疫力的作用,說明冬蟲夏草、西洋參、北沙參三者的合理配比具有提高免疫力的效果,其他三味藥材的組合未體現明顯效果。與正常對照組相比,蟲草扶正方組(冬蟲夏草+西洋參+北沙參+肉桂)、冬蟲夏草+西洋參+北沙參組具有明顯的增強免疫力的作用,且蟲草扶正方組的效果優于冬蟲夏草+西洋參+北沙參組,說明添加肉桂強化了冬蟲夏草、西洋參、北沙參的提高免疫力的效果,進一步說明冬蟲夏草、西洋參、北沙參及肉桂具有協同提高免疫力的作用。

蟲草扶正方組將冬蟲夏草、西洋參、北沙參合理配伍,加強整體配方增強免疫力的功能。本研究證明蟲草扶正方能夠促進機體的免疫功能且具有協同作用,但未深入探究蟲草扶正方增強免疫功能的分子作用機制,有必要在今后對其作用機制及其他功效作進一步探討,從而為此類復合物的應用研究提供更全面的參考信息。