基于AHP-CRITIC混合加權法結合正交設計優選 參芪益氣方提取工藝研究

朱芝慧,龔芬芳,李 慧,4,黃璐琦,5*

(1.江西中醫藥大學 院士工作站,江西 南昌 330004;2.中國中醫科學院 中醫藥健康產業 研究所,江西 南昌 330115;3.江西中醫藥健康產業研究院,江西 南昌 330115; 4.中國中醫科學院 中藥研究所,北京 100700;5.中國中醫科學院,北京 100700)

隨著社會的迅速發展,高強度快節奏的工作模式使亞健康人群日益增加[1]。根據WTO的一項全球性調查研究顯示,如今全世界處于亞健康狀態的群體高達75%[2]。現代臨床醫學表明,在亞健康初期通過適當干預,可以有效阻止其向疾病方向轉變,這與中醫“治未病”思想相吻合[3]。且現代研究發現“補氣”可以改善亞健康人群倦怠乏力、精神萎靡等免疫力低下狀態[4]。參芪益氣方為臨床經驗方,由人參、黃芪、陳皮等6味藥材組成,主要用于提高人體免疫力、改善人體亞健康狀態。方中人參性偏寒而走里,可大補“元氣”、復脈固脫、補脾益肺,為君藥;黃芪性偏溫而走外,可補“衛氣”、生津養血、健脾升陽,為臣藥。君臣兩藥相須協同,陰陽共補,表里結合,大補人體之氣[5-6]。同時方中佐以陳皮理氣燥濕,疏通經絡,暢通氣血,輔助補氣藥更好達到療效。諸藥合用,補氣理氣,陰陽互助,共奏扶正固本、益氣健脾、理氣燥濕之功。因此該方的開發有助于服務亞健康人群,推動“大健康”發展。

本研究以人參皂苷Rg1、Re、Rb1及黃芪甲苷和干膏得率作為提取工藝的評價指標,并建立了一種準確便捷、可同時測定多指標成分的檢測方法,用于優選參芪益氣方提取工藝。此外,本研究在正交試驗設計基礎上,引入更加科學合理的AHP-CRITIC混合加權法分配權重系數,優選參芪益氣方最佳提取工藝,為后期參芪益氣方的制劑開發奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司);Allchrom Model 6100蒸發光散射檢測器(美國奧泰公司);XBridge Shield RP18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);ME204(萬分之一)、XSR105(十萬分之一)型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司);98-I-BN型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1(批號:110703-202034,質量分數94.0%)、人參皂苷Re(批號:110754-202129,質量分數96.0%)、人參皂苷Rb1(批號:110704-202129,質量分數94.3%)、黃芪甲苷(批號:110781-202118,質量分數96.8%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純(美國 Fisher 公司),甲醇為分析純(西隴科學股份有限公司);處方藥材均購自安徽協和成藥業飲片公司,按照 2020 版《中華人民共和國藥典》(一部)項下的相關標準進行檢驗,結果均符合規定[7]。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷對照品適量,加甲醇溶解制成質量濃度分別為0.301 4、0.186 8、0.283 2、0.550 6mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 樣品濃縮液制備 按處方稱取藥材,置圓底燒瓶中,加8倍量水,提取1次,每次1h,進行回流提取,趁熱以200目無紡布濾過,濾液減壓濃縮至一定密度,得樣品濃縮液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取濃縮液10mL,加水飽和正丁醇溶液50mL萃取,共4次;合并正丁醇液,加氨試液50mL,洗滌3次,棄氨試液層,取正丁醇層蒸干,殘渣加甲醇溶解并轉移至5mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.1.4 陰性對照溶液制備 分別稱取參芪益氣方除人參、黃芪以外的其他處方量藥材,按“2.1.3”項下供試品溶液的制備方法處理上述樣品,即得缺人參和缺黃芪的陰性對照溶液。

2.1.5 色譜條件 XBridge Shield RP18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相:乙腈-水,梯度洗脫程序見表1,柱溫:30℃,流速:1mL·min-1,ELSD檢測器,漂移管溫度:106.5℃,以氮氣為載氣,氮氣流速2.9L·min-1,進樣量2～10μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性考察 分別取混合對照品溶液、陰性對照溶液及參芪益氣方供試品溶液各10μL,按“2.1.5”項色譜條件進樣,對系統適用參數進行考察。人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,理論板數以各峰計均在5 000以上,參芪益氣方中其他組分不干擾4種成分的測定,表明該方法專屬性良好。結果見圖1。

注:1.人參皂苷Rg1;2.人參皂苷Re;3.人參皂苷Rb1;4.黃芪甲苷。A.混合對照品B.缺人參陰性對照;C.缺黃芪陰性對照;D.參芪益氣方供試品。

2.2.2 線性關系考察 精密量取人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷的混合對照品母液,用甲醇依次倍半稀釋成系列混合對照品溶液,得到系列質量濃度,按“2.1.5”項下色譜條件測定,以對照品進樣量的對數值為橫坐標(X),峰面積的對數值為縱坐標(Y),計算各成分的回歸方程,結果見表2。結果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷分別在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.2.3 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液,按照“2.1.5”項下色譜條件連續進樣6次,計算各成分峰面積的RSD值,結果見表3。結果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷峰面積的RSD值分別為1.27%、1.67%、2.13%、1.60%,表明儀器精密度良好。

表3 精密度試驗結果 (n=6)

2.2.4 穩定性試驗 按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件,分別在0、2、4、8、12、24h依次進樣測定,計算各成分峰面積的RSD值,結果見表4。結果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷峰面積的RSD值分別為1.49%、2.84%、2.62%、2.02%,表明樣品溶液在24h內穩定性良好。

表4 穩定性試驗結果 (n=6)

2.2.5 重復性試驗 按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份,按“2.1.5”項下的色譜條件進樣,計算各成分濃縮液平均含量和RSD值,結果見表5。結果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷的含量的RSD值分別為1.07%、1.29%、1.62%、0.86%,表明該方法重復性良好。

表5 重復性試驗結果 (n=6)

2.2.6 加樣回收試驗 精密吸取已知含量的濃縮液5mL,平行6份,精密加入含人參皂苷Rg、Re、Rb1和黃芪甲苷對照品溶液適量,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件測定,計算各成分平均加樣回收率和RSD值,結果見表6。結果顯示,人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷的平均加樣回收率分別為97.54%、99.12%、102.97%、100.00%,RSD為1.89%、2.26%、1.17%、2.84%,表明該方法各成分的回收率良好。

表6 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.2.7 干膏得率測定 精密吸取“2.1.2”項下濃縮液10mL,置已恒重的蒸發皿中,105℃干燥至恒重,取出,干燥器中冷卻至室溫,精密稱定質量,按 2020 年版《中華人民共和國藥典》(四部)通則 0831 干燥失重測定法測定,計算干膏得率。

2.3 正交試驗設計優選提取工藝

2.3.1 正交試驗設計 在預試驗基礎上,確定加水量、提取時間和提取次數為影響因素。按比例稱取處方量藥材,以加水量(A)、提取時間(B)和提取次數(C)為考察因素,以各成分轉移率和干膏得率為評價指標,采用L9(34)正交試驗表進行實驗,篩選參芪益氣方最佳提取工藝參數。正交試驗因素水平見表7。

表7 正交試驗因素水平

2.3.2 指標權重的確立 (1)AHP 法確定權重系數[8]。參芪益氣方中人參為君藥,黃芪為臣藥,根據君臣佐使配伍規律和藥理作用,結合參芪益氣方功效主治及組方特點,將各指標性成分和干膏得率作為權重指標予以量化,即將5個指標分成3個層次,并確定各指標的優先順序為人參皂苷Rg1、Re、Rb1優于黃芪甲苷優于干膏得率,構建各指標成對比較的判斷優先矩陣,并得到各成分的評分,結果見表8。結果顯示,人參皂苷Rg1、Re、Rb1、黃芪甲苷的轉移率和干膏得率項指標的權重系數(ω)分別為0.291 9、0.291 9、0.291 9、0.097 3、0.026 9。一致性比例因子(CR)可以評價權重系數是否合理,通過檢驗,本試驗CR=0.080 2<0.10,說明指標成對比較的判斷優先矩陣合理,所得的權重系數可用于參芪益氣方提取工藝的綜合評分。

表8 指標成對判斷優先矩陣

(2)CRITIC 法確定權重系數[9]。CRITIC是一種以評價指標間的對比強度及沖突性作為基礎,通過計算標準差來體現對比強度及沖突性的客觀權重賦值方法。將數據進行線性差值歸一化,消除單位量綱,公式為[指標成分值=(實測值-最小值)/(最大值-最小值)]×100,采用 SPSSAU 在線系統計算各指標的指標變異性、指標沖突性、信息量以及權重,結果見表9。結果顯示,人參皂苷Rg1、Re,Rb1、黃芪甲苷和干膏得率的權重系數分別為0.172 6、0.204 3、0.143 4、0.211 3、0.268 3。

表9 CRITIC 法相關計算數據

2.3.3 AHP-CRITIC 混合加權法確定權重 AHP-CRITIC 混合加權法既保留了 AHP 法的主觀特點,又具有 CRITIC 法的客觀性,較單一的賦權方法來說更加全面合理。將2種方法結合,計算綜合權重(ωij)=ωAHP-ijωCRITIC-ij/∑ωAHP-ijωCRITIC-ij,得到人參皂苷Rg1、Re、Rb1、黃芪甲苷和干膏得率的權重系數分別為0.280 4、0.331 9、0.233 0、0.114 4、0.040 2。

2.3.4 綜合評分及結果分析 綜合評分=[(人參皂苷Rg1轉移率/人參皂苷Rg1轉移率最大量)×0.280 4+(人參皂苷Re轉移率/人參皂苷Re轉移率最大量)×0.331 9 +(人參皂苷Rb1轉移率/人參皂苷Rb1轉移率最大量)×0.233 0 +(黃芪甲苷轉移率/黃芪甲苷轉移率最大量)×0.114 4 +(干膏得率/干膏得率最大量)×0.040 2]×100。

正交試驗直觀分析結果見表10,方差分析結果見表11。從表10中綜合評分的直觀分析結果可以看出,各因素對水提工藝影響的主次為:C>A>B;因素A中K3>K2>K1,提示綜合評分隨加水倍數的增加而增高,選擇溶劑倍量為10倍;因素B中K1>K2>K3,選擇提取時間為1h;因素C中K2>K3>K1,選擇提取次數為2次,因此直觀分析優選的組合為A3B1C2。表11的方差分析結果表明,提取次數(C)對指標成分有顯著性影響,差異有統計學意義(P<0.05)。綜上所示,參芪益氣方的水提工藝以A3B1C2組合為佳,即加10倍量水,提取2次,每次1h。

表10 正交試驗安排及直觀分析結果

表11 指標成分綜合評分方差分析結果

2.4 驗證試驗

按處方稱取藥材,平行3份,按最佳水提工藝進行提取,同法計算各指標成分轉移率、干膏得率和綜合評分,驗證試驗結果見表12。結果顯示3批驗證試驗的平均總評分為95.37,RSD為1.23%,表明本試驗所優選的工藝穩定,重復性好,可作為參芪益氣方的提取工藝。

表12 驗證試驗結果 (n=6)

3 討論

參芪益氣方中人參為君藥,黃芪為臣藥,人參皂苷Rg1、Re、Rb1及黃芪甲苷作為人參和黃芪主要活性成分,具有提高免疫力、抗腫瘤、抗腦缺血再灌注損傷等作用[10-11],但分別檢測兩種皂苷類成分耗時耗力[12-13],故本研究建立了一種可同時測定上述4種活性成分的含量測定方法,大大縮短了分析時間,節省資源,提高檢測效率。經方法學驗證,所建方法準確可靠,重復性好,并通過提取工藝的正交試驗證明了該方法的可行性和適用性,同時也為主要以皂苷結構類型為活性成分的制劑的質量標準提供研究思路。

中藥具有多成分、多療效的特點,在提取過程中各有效成分的轉移率會影響到方劑的療效。因此在工藝優選過程中,以單一成分含量高低為評價指標存在一定局限性。干膏得率也是反映提取工藝的關鍵指標,是制劑成型的重要保證[14]。故本研究選取4種成分的轉移率和干膏得率形成多指標評價體系,可更全面地反映提取工藝的優劣,體現復方的整體性和有效性。由于中藥復方成分復雜,不同成分在提取過程中存在相互作用,使得各成分對復方整體效果的貢獻也不同[15],因此對指標的賦權是中藥提取工藝中多指標評價的重要環節。目前常用的方法有綜合評分法、歸一化法、AHP 法、CRITIC 法等[16]。AHP 法雖然體現出了復方中君臣佐使配伍的規律特點,但也易受主觀判斷而失去客觀性;CRITIC 法可以客觀地評價權重系數,卻也存在完全依賴本身屬性忽視各指標間輕重關系的缺點。基于此,本實驗將兩者方法相結合,使用 AHP-CRITIC 混合加權法賦予指標權重[17],使其既可以避免 AHP 法的主觀臆斷,又能減少 CRITIC 法對指標間重要性的忽視,進一步保證評價結果的準確性和可靠性,使評價結果更為科學合理。

本研究使用 HPLC-ELSD 法對人參皂苷Rg1、Re、Rb1和黃芪甲苷進行測定,并通過L9(34)正交試驗,采用 AHP-CRITIC 混合加權法對權重系數進行綜合評分,優選出參芪益氣方的水提工藝為加10倍量水,提取2次,每次1 h。經驗證實驗表明,該方法穩定可靠,可以為參芪益氣方的進一步開發和利用提供科學的實驗依據。