不同產地密蒙花指紋圖譜研究

丁 青,王利偉,梁月儀,劉曉霞,黃小丹,陳向東,孫冬梅

(廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室,廣東 佛山 528244)

密蒙花為馬錢科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序,是中醫處方和成藥中的常用中藥,具有清熱瀉火、養肝明目、退翳的功效,用于治療目赤腫痛、多淚羞明、目生翳膜、肝虛目暗、視物昏花[1],現代藥理作用有抗炎、抗菌、免疫調節、降血糖、抗氧化、治療帕金森和對抗眼部疾病等[2]。密蒙花主要分布于我國陜西、云南、貴州等地[3]。通過查閱文獻發現,密蒙花中主要成分為黃酮類和苯乙醇苷類[4],從密蒙花中分離鑒定出的黃酮類化合物有木犀草素、蒙花苷、芹菜素、秋英苷等[5],苯乙醇類化合物有毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷等[6]。

由于中藥的藥效常常是多個活性成分的綜合作用,用多指標進行中藥的質量控制已得到整個行業的共識[7]。中藥指紋圖譜著重體現中藥整體特性,但無法表征有效成分的絕對量,無法精準表述中藥質量,為深入挖掘指紋圖譜的內在數據與變量,采用化學模式識別特征性地識別指紋圖譜尤為關鍵[8]。因此,本次研究將建立指紋圖譜結合化學模式識別技術的密蒙花質量控制方法,并在此基礎上對共有指紋峰進行成分鑒別,有利于實現中藥質量的全面控制[9],為深入研究密蒙花藥材質量控制方法提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

儀器:Thermo Vanquish 超高效液相色譜儀,Thermo 二極管陣列檢測器(DAD),Waters ACQUITY HSS T3色譜柱(2.1mm×100mm,1.8μm),Waters ACQUITY HSS T3色譜柱(2.1mm×150mm,1.8μm),ME204E型萬分之一天平(梅特勒-托利多公司),HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司),KQ-500DE型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司),Thermo 超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)。

1.2 試劑

色譜級乙腈和甲醇均購自默克股份有限公司,Milli-Q超純水(實驗室自制);分析級甲醇和乙醇購自西隴科學股份有限公司,蒙花苷(中國食品藥品檢定研究院,批號:111528-201710,含量:96.6%),毛蕊花糖苷(中國食品藥品檢定研究院,批號:111530-201713,含量:92.5%),芹菜素(中國食品藥品檢定研究院,批號:111901-201603,含量:99.2%)。

1.3 材料

本次實驗密蒙花藥材由廣東一方制藥有限公司采購管理部于產地搜集,經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為馬錢科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序。經檢驗均符合2020年版《中華人民共和國藥典》密蒙花藥材項下規定。樣品產地信息見表1所示。

表1 密蒙花樣品信息

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

分別精密稱取蒙花苷、毛蕊花糖苷對照品適量,分加70%甲醇溶解制成質量濃度分別為16.585μg·mL-1、16.125μg·mL-1的溶液。另取芹菜素對照品適量,加70%甲醇溶解制成質量濃度為15.356μg·mL-1的溶液。

2.2 供試品溶液制備

取密蒙花藥材粉末(過三號篩)約0.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入70%甲醇100mL,稱定質量,加熱回流45min,放冷,再稱定質量,用70%甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×150mm,1.8μm);流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫,0～5min,25%→30% A,5～15min,30% A,15～18min,30%→38% A,18～35min,38%→45% A,35～55min,45%→80% A。體積流量0.2mL·min-1,柱溫為30℃,檢測波長為326nm,進樣體積為1μL。

2.4 色譜與質譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm);其余色譜條件同“2.3”項下。

采用電噴霧離子源(HESI),正、負離子分別檢測,毛細管噴霧電壓為3.5kV,毛細管溫度為350℃。樣品掃描采用Full-MS(dd-MS2),一級質譜采集范圍m/z70～1 050,分辨率為17 500,碰撞能(NCE)為20V。

2.5 指紋圖譜建立

取20批不同產地的密蒙花藥材,按“2.2”項下制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣測定,記錄20批密蒙花藥材色譜圖,并將所有的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2012版進行分析。以MMH01為參照圖譜,對20批密蒙花藥材指紋圖譜共有峰進行匹配,選擇分離度較好、峰型對稱、峰純度高、峰面積較大的色譜峰為指紋峰,共標定11個指紋峰,共有峰模式見圖1。

注:5:毛蕊花糖苷;9:蒙花苷;10:芹菜素。

2.6 指紋峰指認

為了深入研究密蒙花成分,本次研究采用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)對密蒙花中的化學成分進行定性分析,根據所獲得的分子碎片峰、精確相對分子質量等色譜信息,快速分析鑒定密蒙花藥材共有指紋峰的成分。

取“2.2”項下供試品溶液,按照“2.4”項下的色譜與質譜條件進行分析,得到密蒙花藥材正、負離子模式下的總離子流圖,如圖2所示。根據實際測得的相對分子質量與理論相對分子質量二者偏差小于5ppm,同位素豐度比以及一級、二級質譜碎片信息等,結合Thermom/zVault數據庫及文獻信息,對11個指紋峰化合物進行推斷鑒別,結果如表2所示。

圖2 密蒙花藥材正離子(A)和負離子模式下總離子流圖(B)

表2 密蒙花指紋峰鑒別結果

2.7 方法學驗證

2.7.1 專屬性試驗 取空白溶劑(70%甲醇)、對照品溶液、密蒙花樣品MMH01供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣,結果表明空白溶劑不干擾指紋峰的檢測。見圖3。

注:5.毛蕊花糖苷;9.蒙花苷;10.芹菜素。

2.7.2 精密度試驗 取密蒙花樣品MMH01供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣,連續進樣測定6次,以3號峰(毛蕊花糖苷)為參照峰,計算11個指紋峰的相對保留時間RSD值在0.01%～0.08%范圍內,相對峰面積RSD值在0.41%～1.70%范圍內,表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩定性試驗 取密蒙花樣品MMH01供試品溶液,于室溫下放置,分別在制備后的0h、3h、4h、6h、13h、24h進樣測定,以3號峰(毛蕊花糖苷)為參照峰,計算11個指紋峰的相對保留時間RSD值在0.01%～0.10%范圍內,相對峰面積RSD值在1.40%～2.38%范圍內,表明供試品溶液在24h內穩定。

2.7.4 重復性試驗 取同一批密蒙花樣品粉末6份,按“2.2”項下制備6份供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣測定,以3號峰(毛蕊花糖苷)為參照峰,計算11個指紋峰的相對保留時間RSD值在0.01%～0.06%范圍內,相對峰面積RSD值在0.59%～2.96%范圍內,表明該方法重復性良好。

2.7.5 指紋圖譜的建立及相似度評價 將所有的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》,采用平均數法生成對照指紋圖譜,對照指紋圖譜見圖4,并進行相似度計算,MMH01～MMH20指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均>0.90,相似度結果見表3,表明各批次藥材之間的質量比較穩定。

注:5:毛蕊花糖苷;9:蒙花苷;10:芹菜素。

表3 20批密蒙花藥材相似度計算結果

2.8 指紋圖譜化學模式識別分析

2.8.1 系統聚類分析 采用SPSS 20.0軟件,對20批密蒙花指紋圖譜共有峰峰面積進行標準化處理,采用Ward法,以平方歐氏距離為測度,全矩從-1至1標準化轉化,進行聚類分析,結果見圖5。當類間距離在15時,密蒙花藥材被分為3類,其中MMH01～MMH03、MMH10～MMH12聚為第Ⅰ類,其中MMH01～MMH03來源于陜西省安康市,而MMH10～MMH12來源于云南省德宏市;MMH09、MMH15、MMH16～MMH20聚為第Ⅱ類,均來源于貴州省凱里市;MMH04～MMH08、MMH13～MMH14聚為第Ⅲ類,其中MMH04～MMH06、MMH14來源于陜西省安康市,MMH07～MMH08、MMH13來源于四川省綿陽市。

圖5 20批密蒙花樣品聚類分析樹狀圖

將20批密蒙花指紋圖譜共有峰峰面積同時采用SIMCA14.1軟件繪制PCA得分圖,結果見圖6。由PCA得分圖可知,20批密蒙花藥材分成3類,與系統聚類分析結果一致。

分類結果表明貴州省凱里市、云南省德宏市、四川省綿陽市產區的密蒙花藥材可以實現較好的分類,表明這3個產地的藥材質量各自具有一定的相似性,而陜西省安康市的密蒙花藥材有4批能與四川省綿陽市產區的樣品聚為一類,另有3批能與云南省德宏市產區的樣品聚為一類,表明陜西省安康市的藥材質量波動較大。

2.8.2 主成分分析 采用SPSS 20.0軟件,將20批密蒙花指紋圖譜共有峰峰面積進行標準化處理,計算主成分特征值、累計貢獻率及主成分得分。以特征值>1為標準,提取出的主成分有3個,累積方差貢獻率為84.64%,表明提取出的3個主成分反映了20批密蒙花藥材指紋圖譜的主要信息,碎石圖進一步說明了3個主成分可以表征密蒙花的整體特征,見圖7。由于載荷值越高,表明變量對主成分的影響越大。根據載荷矩陣表4,可知主成分1主要與峰1、峰2、峰5、峰9有關,主成分2主要與峰3、峰6、峰11有關,主成分3主要與峰3、峰8有關,表明密蒙花的質量差異是由多個成分同時影響,因此密蒙花藥材質量應采用多指標成分共同控制。

圖7 20批密蒙花樣品主成分分析碎石圖

表4 20批密蒙花樣品載荷矩陣

2.8.3 正交偏最小二乘判別分析 為了進一步明確上述3類密蒙花藥材之間產生差異的主要標志物,采用OPLS-DA對20批密蒙花藥材進行對比分析。由于VIP值越大,表明該化學指標對于解釋變量的貢獻越大,因此可以VIP>1作為標準,得出密蒙花藥材之間的差異標志物。使用OPLS-DA建模分析,篩選出3個預測主成分,累積解釋能力參數R2x和R2y分別為0.9、0.7,預測能力參數Q2為0.5,表明所建立的模型穩定、可靠。以VIP>1的色譜峰為差異標志物,如圖8所示,峰6、峰3、峰11、峰1、峰7、峰8的VIP值分別為1.19、1.11、1.11、1.08、1.06、1.02,因此峰6、峰3、峰11、峰1、峰7、峰8可作為區分密蒙花質量差異標志物。

圖8 密蒙花藥材指紋圖譜OPLS-DA模型的VIP得分

3 討論與結論

3.1 指紋圖譜條件確定

本研究對供試品溶液的制備進行了優化,考察了提起溶劑、提取方式對指紋圖譜測定結果的影響,結果表明,當采用70%甲醇為提取溶劑,加熱回流為提取方法時,11個指紋峰的響應最大。對比了0.1%磷酸溶液、0.1%甲酸溶液、0.1%乙酸溶液對色譜峰分離效果的影響,結果表明,當采用0.1%甲酸溶液為水相流動相時分離效果最佳。在200～400nm范圍內進行全波長掃描發現,當檢測波長為326nm時,各指紋峰響應最大,色譜峰信息全面,因此本研究在326nm下測定。

3.2 化學模式識別分析

對密蒙花藥材指紋圖譜采用相似度分析、系統聚類分析、主成分分析方法以及正交偏最小二乘判別分析,以全面評價藥材質量。通過PCA分析和聚類分析發現,采自陜西省安康市的7批樣品被分成2類,有4批能與四川省綿陽市產區的樣品聚為1類,另有3批能與云南省德宏市產區的樣品聚為1類,表明該產區的藥材質量差異較大,對這7批樣品的指紋峰峰面積進行分析發現,MMH01～MMH03的峰5(毛蕊花糖苷)的峰面積為4.556～6.594,MMH04～MMH06、MMH14的峰5(毛蕊花糖苷)的峰面積為6.925～15.685,后4批的峰5的峰面積明顯高于前3批,說明毛蕊花糖苷的含量具有一定差異,這可能是二者各自聚為1類的原因,因此在后續研究中可以增加該指標定量測定。通過OPLS-DA分析篩選出6個差異性標志物,因此在后續研究中可以重點關注峰1、峰3、峰6、峰7、峰8、峰11,可采用多指標成分測定對密蒙花藥材進行質量控制。

3.3 色譜峰指認

密蒙花指紋圖譜11個指紋峰,其鑒定依據主要是根據二級質譜碎片離子與文獻報道[10]進行比對推導。例如,保留時間為9.52min的峰1,負離子掃描模式下準分子離子峰為m/z621.110 7,二級裂解碎片可見m/z445.078 0、m/z269.045 7,通過Xcalibur數據處理平臺,以及文獻報道鑒定該化合物為Clerodendrin;保留時間為10.15min的峰2,負離子掃描模式下準分子離子峰為m/z785.251 6,二級裂解碎片可見m/z623.219 5、m/z161.023 4,通過Xcalibur數據處理平臺及文獻報道鑒定該化合物為Echinacoside;保留時間為20.78min的峰6,負離子掃描模式下準分子離子峰為m/z447.093 8,二級裂解碎片可見m/z285.040 7、m/z327.052 8,通過Xcalibur數據處理平臺及文獻報道鑒定該化合物為木犀草苷。保留時間為37.16min的峰8,正離子掃描模式下準分子離子峰為m/z739.245 3,二級裂解碎片可見m/z593.187 2、m/z285.075 8,通過Xcalibur數據處理平臺以及文獻報道鑒定該化合物為Neobudofficide。對于尚未采用對照品再驗證的化合物,還需進一步采用對照品進行確證。

3.4 結論

本實驗建立了密蒙花指紋圖譜檢測方法,該方法穩定且專屬性較好。對不同產地的密蒙花藥材指紋圖譜采用相似度分析及化學計量學進行分析發現,貴州省凱里市、云南省德宏市、四川省綿陽市產地的藥材質量各自具有一定相似性;并且不同產地并找到6個密蒙花藥材質量差異性標志物,通過UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術以及Thermom/zVault數據庫及文獻信息已推測出其分子式,這可為更加全面評價密蒙花藥材質量提供借鑒。