基于“傳統+分子生物學”聯用技術鑒定 云南華寧產四數九里香藥材

周永福,姚如杰,黎學明

(1.重慶工業職業技術學院 應用技術推廣中心,重慶 401120;2.重慶紫光化工股份 有限公司 技術中心,重慶 401121;3.重慶大學 化學化工學院,重慶 400044)

民族藥“一物多名”“同名異物”“一藥多原”現象突出。四數九里香(MurrayatetrameraHuang)為蕓香科(Rutaceae)九里香屬(Murraya)植物,主要分布于云南、廣西、廣東、湖南;藥用記載始于《文山中草藥》,后作為民族藥收載于《中國民族藥志要》[1]中,民族藥名為千只眼。《云南省中藥材標準》記載:“本品為蕓香科植物千只眼MurrayatetrameraHuang的干燥葉和帶葉嫩枝;夏、秋季采集,陰干;性辛,溫;歸肺、肝經。”有祛風解表、行氣止痛、活血散瘀的功效,用于治療感冒發熱、咳嗽、目赤澀痛、皮膚瘙癢、濕疹、風濕麻木、筋骨疼痛、瘀血腫痛。近期研究表明,四數九里香具有良好的藥理活性及較高的藥用價值[2],目前,因其富含生物堿且具有多種藥理作用,有希望成為抗腫瘤新藥[3]而備受關注。

然而,關于四數九里香的分類學長期存在爭議[4]。原因有以下幾點:一是四數九里香別名多,如滿山香、滿天香、過山香、千只眼、四數花九里香、臭漆、透光草、穿花針,存在與其他種共用別名現象;二是部分處方所用藥為替代品,如中成藥“三九胃泰”的主藥之一,有文獻報道的是九里香[5],學名為Murrayaexotica(L.),有的報道是四數九里香[6-7],學名為MurrayatetrameraC.C.Huang;三是四數九里香學名不統一,如有MurrayatetrameraC.C.Huang[8]、MurrayatetrameraHuang in Acta Phytotax.Sin[9]、MurrayatetrameraHuang[10];四是學名一致,但因揮發油成分不一,導致對四數九里香的分類存在爭議[11-13]。

近年來,由于PCR技術的快速發展,使得分子鑒定技術正逐漸成為中藥鑒定的主要手段[14-15]。DNA條形碼作為分子鑒定技術的一種方法,早在2003年由加拿大生物學家Paul Hebert教授提出,因其具有種內變異小、種間變異大及變異區兩端序列高度保守等特點,被用于物種的鑒定和識別[16-18]。ITS2序列作為DNA條形碼具有獨特優勢:通用性強,種間變異高于種內變異,擴增片段長度適宜,擴增效率高[19]。陳士林[20]對6 000余份藥用植物樣本進行DNA條形碼序列探索和研究,結果表明ITS2序列的鑒定能力優于國際條形碼協會植物工作組提出的matK和rbcL組合,故首次提出將ITS2作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。

本文為有效解決四數九里香分類學存在的問題,課題組結合現代生物學技術,提出采用“傳統+分子生物學”技術聯用鑒定云南華寧產四數九里香的方法,從植物來源、外觀評價、顯微鑒定、理化鑒定、薄層色譜鑒定、分子生物學6個方面系統鑒定本地四數九里香植物,以期為該民族藥分類學研究提供參考。

1 實驗材料

藥材來源于蕓香科(Rutaceae)九里香屬(Murraya)四數九里香M.tetrameraHuang的干燥葉,2016年2月采自于云南省華寧縣。鑒定彝藥千只眼所涉及到的實驗材料見表1。序列的Genbank登錄號見表2。

表1 千只眼分子生物學鑒定儀器及材料

表2 NCBI數據庫中的九里香屬植物ITS2序列 及GenBank登錄號信息

2 實驗方法

2.1 傳統鑒定方法

采用傳統的鑒定方法(植物來源、外觀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒別)對四數九里香藥材進行鑒定。

2.2 分子鑒定方法

2.2.1 RNA提取方法 四數九里香葉片總RNA的提取步驟及方法按北京天根生化科技(北京)有限公司植物基因組試劑盒提取。四數九里香葉片組織經過無水乙醇清洗干凈后,取植物組織(干重)約30mg,加入液氮、碾磨;將研磨好的粉末迅速轉移到預先裝有700μL,65℃預熱緩沖液GP1的離心管中(實驗前在預熱的GP1加入巰基乙醇使其終濃度為1%),迅速顛倒混勻后,將離心管放于65℃水浴20min,水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數次;加入700μL氯仿,充分混勻,12 000rpm (～13 400×g) 離心5min;小心地將上一步所得上層水相轉入一個新的離心管中,加入700μL緩沖液GP2,充分混勻;將混勻的液體轉入吸附柱CB3中,12 000rpm (～13 400×g) 離心30sec,棄掉廢液;向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12 000rpm(～13 400×g)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中;向吸附柱CB3中 加入600μL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12 000rpm(～13 400×g)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中;將吸附柱CB3放回收集管中,12 000rpm(～13 400×g)離心2min,倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液;將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200μL洗脫緩沖液TE,室溫放置2～5min,12 000rpm(～13 400×g)離心2min,將溶液收集到離心管中。

2.2.2 PCR擴增方法 根據GenBank登錄的九里香屬ITS2序列保守區域設計一對擴增引物,引物序列見表3,由成都擎科偉業有限公司提供。PCR反應體系及擴增條件見表4、表5。

表3 四數九里香ITS2基因的擴增引物

表4 擴增引物反應體系

表5 PCR 擴增儀擴增條件

根據計算,按照一定比例配制足量的PCR反應體系,體系包括ddH2O8.5μL,正反向引物各1.0μL,I-5TM2x High-Fidelity Master Mix 12.5μL,模板DNA 2μL,為25μL。

擴增程序:預變性:98℃、2min;循環:98℃、10s;退火:55℃、30s;延伸:72℃、30s;循環35次;末次延伸為72℃、5min,4℃,5min。PCR反應設置不含DNA模板的溶液作為空白對照。

2.2.3 凝膠電泳方法 取0.2g的瓊脂糖粉末,置于150mL錐形瓶中,加入適量的電泳緩沖溶液TBE,制得1.5%瓊脂糖凝膠液,冷卻、制得支持物,根據擴增產物的位點,用相應的酶切。取PCR擴增產物通過1.5%瓊脂凝膠電泳檢測,在150V、100mA的電場強度下,通過分子篩效應篩選20min,觀察溴酚藍帶的移動現象,待電泳分離后,于紫外透視儀觀察圖譜,獲得符合理論的雙向測序片段。

2.2.4 系統進化樹構建 將測序所得的文件用軟件對測序結果校對和拼接,直接將四數九里香的ITS2基因核苷酸序列(450bp),拼接結果與表2(序列的GenBank登錄號)進行Blast比對,計算K2P遺傳距離,再構建系統進化樹。

3 實驗結果

3.1 藥材來源

2016年2月,課題組在云南苗嶺山莊藥業股份有限責任公司專家周玉忠(苗藥專家)的指導和帶領下,親赴云南省華寧縣青龍鎮馬鹿塘村委會馬鞍山村(民族村)的河谷(當地叫喜黑山谷)采樣。四數九里香被當地民族(苗族)稱為“蒙鼻諸第日”,而貴州松桃地區苗人稱為“Ndutjeub”。樣品后經成都中醫藥大學陳新教授鑒定為蕓香科(Rutaceae)九里香屬(Murraya)四數九里香M.tetrameraHuang植物。目前,標本保存于重慶工業職業技術學院藥物化學研究所,見圖1。

注:該圖為2016年2月周永福攝于云南華寧。

經采樣現場勘查,該植物群落生長在伴有石灰巖的斜坡環境中,植株根系發達,個體高、葉茂盛;該植物群落大、棚數多,占地面積達20公頃,生產年限久遠。課題組在采樣后,樣品經當地居民使用騾馬馱運至機動車能到達處。

3.2 外觀鑒別

該植物生長于伴有石灰巖的斜坡中,喜溫濕氣候,高1～7m;葉片呈披針形或卵形,單數羽狀復葉,小葉5～9片,長0.8～2.5cm,寬0.8～2.0cm,先端鈍尖,基部楔形,見圖2、圖3、圖4,新鮮葉為深綠色,氣味濃,表面有色澤,干燥后呈暗綠色。

圖2 四數九里香干燥葉外觀性狀

圖3 四數九里香生境(二)

圖4 四數九里香莖外觀性狀

3.3 顯微鑒別

四數九里香葉粉末呈現綠褐色,表皮細胞呈不規則形,氣孔多數不定式;非腺毛單細胞長30～100μm,壁厚;葉肉組織成晶纖維;柵欄組織細胞排列成行,含草酸鈣方晶;油室直徑60～120μm,呈圓形,有的內含黃色油滴。

3.4 理化鑒別

取四數九里香粗粉2g(20目),加乙醇20mL,回流提取30min,冷卻、濾過;取濾液5mL,蒸干,殘渣加乙酸乙酯2mL溶解,置試管中,加新制的7%鹽酸羥胺-甲醇溶液與10%氫氧化鉀-甲醇溶液各2～3滴,搖勻,微熱,放冷,加稀鹽酸調節pH值至3～4,加1% TeCl3-CH3CH2OH溶液,反應現象為紫紅色。

3.5 色譜鑒別

取四數九里香粗粉2g(20目),加乙醇20mL,回流提取30min,冷卻、濾過、蒸干,殘渣加甲醇2mL溶解,置樣品瓶中,用毛細管取樣、點板,在展開槽中進行展開,展開劑為丙酮比二氯甲烷=1∶1,在254nm波長處觀察,存在斑點。

3.6 分子鑒定結果

3.6.1 樣品總RNA提取 按照北京天根生化科技(北京)有限公司植物基因組試劑盒提取步驟及方法提取四數九里香葉片總RNA,結果顯示,提取的總RNA質量好,條帶清晰,無明顯降解。

3.6.2 PCR擴增結果 利用所設計的成熟酶K基因擴增引物F1/R2對四數九里香葉的cDNA進行PCR擴增,經擴增之后,采用瓊脂糖凝膠電泳分析方法在150V、100mA 的條件下分析20min,四數九里香的PCR電泳結果顯示亮條帶,得長度約為450bp的擴增片段,PCR產物雙向測序結果見圖5、圖6。測序結果表明該基因為四數九里香的ITS2基因序列。經過NCBI序列相似性比對(Blastn),發現該植物基因核苷酸序列與GenBank中的Murraya tetramera(登錄號:KR532413)的matK基因核苷酸序列一致。

注:M為DL2000 Marker,I為樣本擴增電泳結果。

圖6 樣本測序峰圖(部分)

3.6.3 Matk拼接結果 經過軟件拼接之后,獲得完整的四數九里香高質量DNA序列圖譜;結果為GAAGTAAATATTTGACTCGATACAAACTCTTTT TTGTTGAAGATCCGCTGTAATAATGAGAAAGA TTTCTGCATATACGCACAAATCGGTCGATAAGA TGAGAATCAGAGAAATCGGCCCAGGTCGACTT ACTGATGGGATGCCCTAATGCGTTACAAAACCG CGCCTTAGTCAATGATCCAATCAGATGAATAAT GGGAACGGTCGTATCGACCTTCTTCCTAGAATT ACCTATTAGAAATGAATTTTCTAGCATTTGACT CCGTACCAACAAAGAATTGAGTCGCACACCGG AAAGATAGCCCAGAAAGTTAATAGCGTACTTGC CTAAATATAAGTGGTTTAGCTGAACCCTTCCTGGTCGAGAAGACACGTGAAAATGCCATTGCCATA AACCGACAAGGTAATATTTCCATTTATTCATCAG AAGAGGCGTATCCTTTGAAGCCAAAATGGATTT TCCTTGATATCTAACATAATGCATGAAAGGATCC TTGAACAACCCTAAGATGTCCGGAAAATCTTTA GCAACATCTTCGACAAGATGTTCGACTTTTCCA TAGAAATACATTCGCTCAACGAGGACTCGAGAG GATGTTGATTGTAAATGAGATGCTTGGTTACAG AGAAAAAAGAGGATGGATTCATATTCATATACAT GAGAATTATATAGAAACAATAACAATCTTGGATT ACTTTTTAAAAAAACAGAAATAGAGTTCTTTG GAGTAATAAGACTGTTCGAATTAAAATACTCGT GGAGAAAGAACCGTAATAAATGTAAAGAAGAG GCATCCTTTACCCAGTCGCGAAGGGTTTGAAC CAGGATTTCGGGACAAGTGGGGTGGGGTATTC GTACATCTAACACATAATTTAAATGGGACAATT TATCC。該研究結果為云南華寧產四數九里香提供分子生物學鑒定依據。

3.6.4 系統發育樹構建 對四數九里香的ITS2基因進行測序獲得其高質量的DNA序列,利用MEGA6.0軟件與GenBank中下載的九里香屬植物ITS2序列鄰接、構建聚類系統發育樹,見表6、圖7。從構建的NJ樹可以看出,所分析樣品與GenBank中的四數九里香聚為一支,說明可以將所分析的樣品與四數九里香歸為一個種,因此,ITS2序列作為條形碼可以快速準確鑒別民族藥四數九里香及其同屬植物,這一結論與外觀評價一致,為外觀評價準確性提供分子證據。

注:*YB為四數九里香植物樣本,下同。

表6 九里香屬植物ITS2序列遺傳距離分析

3.6.5 遺傳距離 將各序列用Mega 6.0軟件進行樣本序列比對之后,與NCBI數據庫中九里香屬植物ITS2序列的K2P遺傳距離進行對比,結果見表6,發現樣本與九里香屬植物的K2P遺傳距離介于0.017～0.048之間,其中與四數九里香(M.tetramera)K2P的遺傳距離最小為0.017,與小葉九里香(M.microphylla)和調料九里香(M.koenigii)K2P遺傳距離最大均為0.048。

4 討論與結論

近年來,關于民族藥四數九里香的研究和報道主要集中在化學成分及其藥理作用方面,而針對于其物種鑒別鮮有報道。隨著PCR技術的快速發展,分子鑒定技術已經成為中草藥鑒定的主要手段,本文從藥材來源、外觀評價、顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒定、分子生物學鑒定六個層面系統地對民族藥四數九里香進行鑒定研究。采用Mega 6.0軟件計算檢測四數九里香DNA序列與NCBI數據庫中九里香屬植物ITS2序列的K2P遺傳距離,并進行了比對,發現民族藥四數九里香與數據庫中的K2P遺傳距離最小,為0.017;同時采用鄰接法構建系統發育進化樹發現檢測樣本與四數九里香聚為一致;此結果為民族藥四數九里香在基原及品種鑒定上提供了依據。