續斷種子方對少弱精子癥大鼠附睪精子成熟的干預作用及其機理研究?

黃子彥,張亞光,陳豪特,王權勝△

(1.廣西中醫藥大學第一臨床醫學院,南寧 530001;2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,南寧 530023;3.廣西中醫藥防治醫學分子生物重點實驗室,南寧 530023;4.杭州市中醫院,杭州 310007)

少弱精子癥是導致男性不育的重要原因之一,中醫藥治療少弱精子癥存在優勢[1-2],而續斷種子方對于少弱精子癥存在治療效果,其在臨床研究與基礎研究方面有著一定前期基礎[3-5]。2021年第6版《世界衛生組織人類精液檢測與處理實驗室手冊》精子總數與前向運動精子兩項較第5版數值略有降低[6],提示人類精子質量存在逐步下降的可能性。精子的發生發育過程具有程序化的特征,即“精原細胞-精母細胞-精子細胞-精子”的生長發育與減數分裂的鏈式過程,在此過程中精子產生于睪丸,成熟于附睪[7],附睪尾部和精液中精子的形態、結構與功能的完整性存在差異,這一過程中的各個時間空間節點異常都有可能影響精子的數量與活動力[8],如精索靜脈曲張、男性生殖系感染、糖尿病與慢性肝炎等全身性疾病、抗精子抗體、單核苷酸多態性、基因變異等[9-10],而在附睪部分主要與附睪分泌蛋白、附睪內細胞因子等附睪微環境因素有關。酪氨酸蛋白激酶2/信號傳導及轉錄激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信號通路廣泛參與細胞應激、增殖、分化和凋亡等多種生物效應,與精子形態功能關系密切[11]。本研究通過建立實驗性大鼠少弱精子癥模型,嘗試從JAK2/STAT3通路基于附睪管局部顯微、超微結構研究續斷種子方對少弱精子癥模型大鼠附睪微環境的作用,續斷種子方干預少弱精子癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

48只雄性SD大鼠,6～8周齡,體質量200～220 g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,SCXK(湘)2019-0014)。飼養于廣西中醫藥防治醫學分子生物重點實驗室動物房,溫度19～25 ℃,濕度55%～65%,每日光照10～12 h,自由進食飲水,3 d更換一次籠中玉米芯墊料。

1.2 主要試劑與儀器

JAK2抗體、STAT3抗體購自美國CST公司,貨號分別為3230、9139;WLJY-9000型精子質量檢測系統,北京偉力新世紀科技發展有限公司;Finesse E型半自動輪轉切片機,美國Thermo Fisher公司;EG1150H+C型石蠟包埋機,德國Leica公司;BX43型倒置相差顯微鏡,日本Olympus公司;JY-ZY3型半干式轉移電泳槽,濟南君意生物科技有限公司;5200 Multi型全自動化學發光/熒光圖像分析系統,上海天能科技有限公司;XH-C型渦旋混合器,江蘇榮華實驗器材有限公司;Epoch型酶標儀,美國BioTek公司;DYCZ-25E型電泳儀,北京六一生物科技有限公司;5430 R型臺式冷凍離心機,德國Eppendrof公司;Tecnai G220型透射電子顯微鏡,美國FEI公司。

1.3 制備藥物

續斷種子方顆粒劑(主要藥物組成:菟絲子10 g、杜仲10 g、續斷10 g、骨碎補10 g、女貞子10 g、枸杞子10 g、黨參10 g、白術10 g、山藥10 g),劑型采用天江藥業免煎顆粒(江陰天江藥業有限公司,藥品許可證號:1203002);左卡尼汀口服溶液(東北制藥總廠,國藥準字H19990372,規格:10 mL);注射用環磷酰胺(德國Baxter公司,進口藥品注冊證號:H20160467,規格:0.2 g)。

1.4 分組與制作動物模型

適應性飼養1周,在此過程中每日觀察大鼠進食、飲水、活動是否正常,然后制作動物模型,按照隨機數字表法將48只大鼠隨機分為模型組、續斷種子方組、左卡尼汀組、空白組,每組12只。除空白對照組大鼠外,其他組大鼠均采用 80 mg/kg/d環磷酰胺以0.9%氯化鈉溶液稀釋后連續7 d腹腔注射造模[12],造模完成后通過精子質量檢測造模是否成功。

1.5 給藥

造模第8天開始給藥,模型組大鼠每天給予0.9%氯化鈉溶液4 mL灌胃;續斷種子方組予續斷種子方配方顆粒10 g/kg/d溶于0.9%氯化鈉溶液灌胃,左卡尼汀組予左卡尼汀口服溶液100 mg/kg/d溶于0.9%氯化鈉溶液灌胃;持續8周。

1.6 觀察與檢測

1.6.1 精子質量檢測 末次給藥后斷頸處死大鼠,摘取各組大鼠附睪組織,沖洗、剪碎、浸泡,參考WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準測定精子參數[6]。

1.6.2 大鼠附睪組織顯微及超微結構觀察 取大鼠附睪組織,固定、包埋、切片機連續切片,脫蠟后進行HE染色,封片后光學顯微鏡觀察并拍照,光鏡下觀察各組附睪組織常規病理變化,包括結構完整性、附睪上皮、生精細胞、精子、附睪間質等。取2 mm3附睪組織,加入2.5%戊二醛,在4 ℃保存,經固定、滲透,后將標本放入包埋板中固定48 h,超薄切片機切片,厚度80～100 nm,鈾鉛雙染色標本,最后用電鏡觀察。電鏡下觀察各組附睪組織超微結構變化,如細胞核、染色質、溶酶體、核仁、線粒體等。

1.6.3 Western blot檢測JAK2和STAT3蛋白表達 將附睪組織用研磨儀研磨粉碎,加入蛋白裂解液,充分裂解,重復5次;4 ℃ 10 000 g離心10 min,取上清液,加蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min,使用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel,SDS-PAGE) ,電泳、分離蛋白,然后修剪,根據膠的大小剪好吸水紙和聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,并放入轉膜液中浸泡,放入電轉槽中轉膜,再用5%脫脂牛奶搖床上孵育45 min,取出封閉過后的膜震蕩洗滌,加入JAK2(1:1 000)、STAT3(1:1 000)一抗4 ℃孵育過夜,放入緩沖液中震蕩洗滌,再加入二抗孵育1 h,用TBST緩沖液洗膜,顯色后在成像系統進行曝光成像,應用Image J軟件對蛋白條帶進行分析。

1.6.4 免疫組化檢測JAK2和STAT3蛋白表達 取附睪組織石蠟切片5 μm,滴加3%的過氧化氫,5%牛血清白蛋白溶液封閉后,分別加JAK2(1:200)、STAT3(1:200)一抗,4 ℃恒溫過夜、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗后,滴加二抗,然后顯色、復染,脫水封片后鏡檢并拍照,陽性細胞染成棕黃色,使用Image J軟件分析目標蛋白平均光密度值。

2 結果

2.1 一般情況

造模后的3組大鼠均出現不同程度的進食和飲水減少,精神不振,毛發光澤度降低、干枯掉落,活動減弱等表現;空白組大鼠外觀、飲食與活動情況未見明顯異常。在給藥期間部分大鼠脫落,原因可能與環磷酰胺毒性或捕捉灌胃應激反應有關。

2.2 續斷種子方對模型大鼠精子濃度及總活動力的影響

與空白組大鼠比較,模型組大鼠的精子濃度與總活動力明顯下降(P<0.01);與模型組大鼠比較,續斷種子方組大鼠的精子濃度與總活動力明顯上升(P<0.01);與左卡尼汀組大鼠比較,續斷種子方組大鼠的精子濃度與總活動力上升(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠附睪精子濃度及總活動力

2.3 續斷種子方對大鼠附睪物理支持結構的影響

光鏡下,模型組大鼠附睪結構完整性可見明顯破壞,病理改變呈區段性。上皮細胞數量較少,管腔中存在非精子成分,精子濃度較低且分布不均勻,附睪間質內結構出現缺損,見圖1A。續斷種子方組大鼠附睪各區段結構相對完整,細胞排列整齊,附睪間質稍見水腫,部分巨噬細胞與淋巴細胞浸潤,管腔內刷狀緣形態基本正常,含大量成熟精子,與少量畸形、不成熟精子,見圖1B。左卡尼汀組大鼠附睪上皮完整度較模型組高,細胞排列整齊,偶可見上皮退化、變形,精子濃度較模型組高,有部分畸形精子存在,附睪間質輕度水腫,微小血管擴張,見圖1C?？瞻捉M大鼠附睪組織結構完整,刷狀緣形態正常,附睪上皮細胞層次清晰,排列整齊有序,管腔內精子密集,見圖1D。

電鏡下,模型組大鼠附睪上皮細胞排列紊亂松散,可見主要為單層排列,游離面微絨毛大幅度減少,部分細胞呈空泡樣變性。細胞核較小、畸形或呈固縮狀態,核膜褶皺,核內染色質分散,核仁未窺及,可見細胞質中的線粒體腫脹且數量明顯少于空白組,部分上皮細胞甚至出現空泡樣變。附睪管腔面可見脫落胞質,管腔內多為不成熟、畸形精子,見圖2A。續斷種子方組大鼠附睪上皮細胞超微結構與空白組大鼠相近,細胞排列較整齊致密且形態結構完整,游離面微絨毛較模型組豐富,部分細胞空泡化程度較模型組輕。細胞核多位于基底部,大小適中,核內染色質均勻分布,核仁明顯,核膜出現部分皺折,局部偶有內陷,細胞質內細胞器結構相對完整,圓形線粒體、溶酶體較豐富,高爾基體較模型組多。附睪管腔內雖可見小部分畸形精子,但結構正常的成熟精子占多數,見圖2B。左卡尼汀組大鼠附睪上皮細胞排列整齊,游離面微絨毛較模型組明顯豐富。細胞核細胞質中粗面內質網結構相對完整,線粒體數量較多,層次分明。相較于模型組大鼠,空泡樣改變的細胞較少且附睪管腔內結構正常的精子較多,見圖2C?？瞻捉M大鼠附睪上皮細胞結構完整且邊緣清楚,可見正常形態結構的細胞,排列整齊嚴密有序,細胞核較大,基膜連續完整,核仁清晰明顯,核內染色質分布均勻,附睪管管腔中成熟精子大量存在,見圖2D。

2.4 Western blot檢測JAK2和STAT3蛋白表達

各組大鼠Western blot檢測分析結果顯示,與空白組大鼠比較,模型組大鼠JAK2、STAT3在附睪組織中的表達水平明顯下降(P<0.01);與模型組大鼠比較,續斷種子方組大鼠JAK2、STAT3在附睪組織中的表達水平明顯上升(P<0.01),左卡尼汀組大鼠JAK2表達明顯上升(P<0.01),STAT3表達上升(P<0.05),見圖3。

注:與模型組比較*P<0.05,**P<0.01;與左卡尼汀組比較##P<0.01;酪氨酸蛋白激酶2(JAK2),信號傳導及轉錄激活因子3(STAT3)A.模型組;B.續斷種子方組;C.左卡尼汀組;D.空白組

A.模型組;B.續斷種子方組;C.左卡尼汀組;D.空白組

A.模型組;B.續斷種子方組;C.左卡尼汀組;D.空白組

2.5 免疫組化法檢測JAK2與STAT3表達

如圖4所示,模型組大鼠JAK2蛋白棕黃色陽性表達低見圖4A;續斷種子方組大鼠見圖4B與左卡尼汀組大鼠見圖4C的JAK2蛋白棕黃色陽性表達較模型組高;空白組大鼠JAK2蛋白棕黃色陽性表達最高,見圖4D。

如圖5所示,模型組大鼠STAT3免疫組化棕黃色陽性表達低,見圖5A;與模型組大鼠比較,續斷種子方組大鼠(圖5B)與左卡尼汀組大鼠(圖5C)附睪的STAT3棕黃色陽性表達更高;空白組大鼠STAT3免疫組化中棕黃色陽性表達最高(圖5D)。另外,STAT3蛋白在模型大鼠附睪中的精子頭部表達相對豐富。

如圖6所示,與空白組大鼠比較,模型組大鼠JAK2、STAT3表達明顯下降(P<0.01);與模型組大鼠比較,續斷種子方組大鼠和左卡尼汀組大鼠JAK2、STAT3表達明顯上升(P<0.01)。

注:與模型組比較**P<0.01;與左卡尼汀組比較##P<0.01;酪氨酸蛋白激酶2(JAK2),信號傳導及轉錄激活因子3(STAT3)A.模型組;B.續斷種子方組;C.左卡尼汀組;D.空白組

3 討論

JAK2/STAT3通路能介導來自多種細胞因子的信號轉導,在多種致病因素的侵襲導致相關細胞因子的釋放和疾病的進展中發揮重要作用,參與調控細胞的增殖凋亡過程[13-15],亦是各種理化因素誘導的廣泛的組織細胞損傷及相應病理改變的機制之一[16-18],與細胞的各種生理和病理功能有關,其關鍵蛋白在精子中與激活核轉錄、精卵識別與精子活動相關。精子活動能源在于線粒體,在精子中,STAT3主要富集于頭部與鞭毛部位,STAT3受抑制后,線粒體膜去極化上升,伴隨ROS與ATP水平的變化與精子活動力的下降。因此氧化損傷與細胞凋亡相關的附睪輸出小管上皮結構完整性與內環境受破壞,分泌功能失調,JAK2/STAT3信號通路的抑制,精子數量減少,活動力下降,可能是少弱精子癥的發病機制之一。附睪是精子發育成熟的重要場所,精子在附睪中成熟過程的分子機制與參與免疫反應、細胞運動、精子成熟、精子儲存和獲能的某些RNA有關[19],附睪中的特異性蛋白質在精子發育中起著至關重要的作用,如直接參與附睪中精子的成熟、獲能、頂體反應與精卵結合,與管腔液其他成分形成動態平衡的附睪微環境,以及免疫保護、抗菌、抗氧化等作用[20]。環磷酰胺、熱刺激、奧硝唑等各種造模方式導致大鼠睪丸和附睪物理支持結構的破壞與精子發生發育的時空節點受到干擾,進而使得生殖機能出現缺陷[21]。附睪頭部有自己的組織學特征和明確的同質化基因表達模式,專門用于防御和免疫反應以及受精,遠端體和附睪尾部因數量有限的差異表達基因而不同。附睪這種顯著的區域性物理支持結構具有相當的空間特征,與精子在附睪中發育成熟處于不同時間段的時間特征共同構成了附睪結構與功能時空節點相關的微環境。

通過本次實驗我們發現大鼠附睪顯微超微結構的病理改變與精子濃度、活動力可能存在密切聯系。一方面環磷酰胺給藥能導致模型大鼠導致丙二醛、亞硝酸鹽和過氧化氫水平顯著升高,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-S-轉移酶的活性顯著降低。此外,血漿促黃體生成素、卵泡刺激素和睪酮水平降低[22];另一方面,附睪區段性上皮退化變性,同一層面的細胞發育不同步,附睪管柱狀上皮細胞退行性改變,基底部胞質空泡化,各級細胞排列紊亂甚至脫落,部分主細胞、基細胞空泡樣變,附睪管壁結構完整性被破壞,附睪管腔中精子數目明顯減少,非精子細胞成分增加,附睪間質水腫,精子尾部線粒體鞘部分缺失,線粒體溢出,內部結構崩解碎裂導致附睪內分泌功能和附睪管腔內液的成分改變,直至微環境的穩態被破壞從而影響精子發生發育。

本研究以模型大鼠為研究對象,采用補腎健脾益氣的方法進行治療,續斷種子方這一中藥方劑的組方思路源自中醫學經典著作《醫學正印》里的補腎健脾益氣種子煎方,基于“種子土壤學說”的理論且謹守少弱精子癥“營氣不從”的機制遣藥組方,方中續斷、杜仲、菟絲子行少陰益腎溫補填其先天之精,山藥、黨參、白術和緩甘平,走太陰健脾養其后天水谷之精,骨碎補、枸杞子佐助續斷強腎益陽之效,女貞子系方中陽中之陰,陰陽并補則生精有源。本實驗研究結果表明:各組大鼠附睪組織中均有JAK2蛋白和STAT3蛋白的表達,模型組大鼠JAK2蛋白和STAT3蛋白的表達量低于其他3組大鼠,提示少弱精子癥的發生機制可能與附睪JAK2/STAT3信號通路受抑制有關,續斷種子方有可能通過活化JAK2/STAT3信號通路培育附睪精子發育成熟的微環境,有利于精子結構的塑造和獲能。這與本方“精氣互用”改善人體的虛勞狀態的中醫藥理論基本一致[23],為中醫辨證論治少弱精子癥提高其精子質量與配偶妊娠率提供可行的治療途徑。

綜上所述,續斷種子方可能通過調節JAK2/STAT3信號通路維護模型大鼠附睪組織結構的穩定性,培育附睪精子發育成熟的微環境,有利于精子結構的塑造和獲能。