基于Wnt/β-catenin通路探討當歸補血湯防治化療后骨髓造血細胞衰老的機制?

白 瑩,劉俊岑,王佳佳,賈富霞,王文娟

(首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院,北京 100069)

化療是中晚期惡性腫瘤患者常用的治療手段,骨髓抑制是化療藥最常見的不良反應,主要表現(xiàn)為骨髓造血能力下降,外周血細胞或其產(chǎn)物數(shù)量低于正常參考值[1]。骨髓抑制分為急性骨髓抑制和潛在骨髓損傷兩種類型[2]。急性骨髓抑制在接受化療后很快發(fā)生,主要是快速增殖的造血祖細胞凋亡所致,臨床上表現(xiàn)為成熟造血細胞的數(shù)量明顯降低,應用造血生長因子可以促進骨髓造血恢復; 潛在骨髓損傷發(fā)生于急性骨髓抑制之后,主要是由于化療藥物誘導造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)發(fā)生衰老,損傷其自我更新能力,進一步導致HSCs儲備減少,最終惡化為發(fā)育不良和骨髓增生異常綜合征。由于其遲發(fā)性,在臨床上容易被忽視,故臨床預后很差。目前治療急性骨髓抑制的方法有升白細胞藥、造血因子、成分輸血等[3],而對潛在骨髓損傷則缺乏有效防治措施。

骨髓抑制屬于中醫(yī)“虛勞”“血虛”等范疇[4]。中醫(yī)認為化療藥屬藥毒之邪,進入人體后可損傷正氣,耗傷精血,因此氣血虧虛是骨髓抑制的基本病機。臨床治療骨髓抑制均以補氣養(yǎng)血為基本治法,常采用當歸補血湯(Danggui Buxue Decoction,DBD)加味[5]。相關研究發(fā)現(xiàn),DBD對化療后骨髓造血細胞增殖和凋亡有較好的調節(jié)作用[6]。骨髓造血細胞增殖和凋亡與化療后骨髓造血細胞衰老密切相關,本研究計劃在前期結果基礎上,觀察DBD對化療后骨髓造血細胞衰老及相關Wnt/β-catenin通路[7-11]的影響,為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級6～8周齡雄性BALB/c小鼠60只,體質量(20±2)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0011]。動物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心,飼養(yǎng)于寬敞通風的清潔級動物房,溫度20～25 ℃,濕度40%～70%,噪聲<60分貝,照明時間L/D =12 h/12 h,所有實驗動物開始實驗之前先適應性飼養(yǎng)一周自由飲食。所有動物實驗均經(jīng)首都醫(yī)科大學動物倫理委員會批準[倫理編號:AEEI-2018-054]。

1.2 藥品與試劑

DBD:當歸6 g、黃芪30 g,采用中藥配方顆粒劑購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司,批號:當歸21003261,生黃芪21005751,規(guī)格:每袋7 g;環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)購自江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司,批號:18020825,規(guī)格:0.2 g/支,10支/盒;重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rhG-CSF)購自廈門特寶生物工程股份有限公司,批號:202105B06,規(guī)格:75 μg/瓶;小鼠β-半乳糖苷酶(SA-β-galactosidase, SA-β-Gal)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自北京美辰聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司,貨號:MC17266;無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司,批號:100092183;p53 (1C12)一抗,GSK-3β (D5C5Z)一抗,β-Catenin (D10A8)一抗購自美國CST公司,貨號:2524,12456,8480;p21 Cip1一抗,購自上海愛必信生物科技有限公司,貨號:abs131808;放射免疫沉淀法緩沖液,radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA)裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑混合物購自北京普利萊基因技術有限公司,批號:202107258620,202106182221;總RNA提取試劑盒,反轉錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,貨號:DP419,KR116-02;實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)試劑盒購自北京蘭博利德生物技術有限公司,貨號:R0202。

1.3 儀器

血常規(guī)生化儀,型號K4500,日本希森美康公司;低溫冷凍離心機,型號3K15,美國Sigma公司;酶標檢測儀,型號ST-360,上海科華生物工程股份有限公司;脫水機,型號Donatello,意大利DIAPATH公司;包埋機,型號JB-L5,武漢俊杰電子有限公司;病理切片機,型號RM2016,上海徠卡儀器有限公司;電泳儀、電泳槽、電轉儀,型號分別為164-5050、165-6001和170-3930,美國Bio-Rad公司;RT-qPCR儀,型號CFX96,美國Bio-Rad公司;凝膠、化學發(fā)光成像分析系統(tǒng),型號LAS3000,日本Fujifilm公司。

2 方法

2.1 分組、造模和干預

將小鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組,模型對照組,陽性對照組,DBD高、中、低劑量組,每組10只。本次DBD組共連續(xù)給藥10 d,先預防給藥5 d,空白對照組、模型對照組、陽性對照組灌胃蒸餾水,DBD高、中、低劑量組分別按24 g/kg、12 g/kg、6 g/kg灌胃相應中藥(低劑量相當于臨床等效劑量)。第6天除空白對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液外,其余組按100 mg/kg腹腔注射CTX,每日1次,連續(xù)造模3 d。造模期間開始干預用藥,陽性對照組按30 μg/kg皮下注射rhG-CSF,其他組按照預防給藥期間的給藥方案每日給藥1次,連續(xù)5 d。第11天取材。

2.2 血常規(guī)檢測

小鼠眼眶取EDTA-K2抗凝血50 μL,全自動血細胞分析儀檢測外周血常規(guī)。

2.3 器官指數(shù)計算

頸椎脫臼處死小鼠,取肝、脾、胸腺,稱重。計算器官指數(shù)(器官指數(shù)=器官重量/小鼠體質量)。

2.4 ELISA檢測骨髓造血細胞SA-β-Gal含量

取小鼠雙側股骨,反復沖洗骨髓腔,收集骨髓造血細胞。取部分骨髓造血細胞,提取總蛋白,定量后,采用SA-β-Gal ELISA試劑盒檢測,標準品孔和樣本孔中加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的檢測抗體100 μL,封板膜封閉后37 ℃恒溫箱中孵育60 min。洗板后,每孔加入底物A,B,37 ℃避光孵育15 min后,15 min之內(nèi),于450 nm處測定OD值。繪制標準曲線,計算樣本SA-β-Gal含量。

2.5 髂骨造血組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining, HE)染色

取小鼠右側髂骨,10%中性福爾馬林固定,進行骨組織脫鈣、石蠟包埋,采用切片機切片(最大面切開),HE染色,光鏡下拍片。

2.6 Western blot檢測骨髓造血細胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表達

取骨髓造血細胞,加入RIPA提取蛋白,定量煮沸,蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,加入含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉2 h,分別加入p21、p53、GSK-3β、β-catenin抗體(1:1 000)和內(nèi)參β-actin 抗體(1:2 000),4 ℃孵育過夜;含吐溫的Tris-HCl緩沖鹽溶液(Tris Buffered Saline with tween, TBST)洗滌3次,10 min/次。加入HRP標記的二抗(1:5 000)室溫孵育1 h,洗膜,ECL顯影。采用Image J軟件進行條帶灰度值分析,以β-actin為內(nèi)參計算p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表達。

2.7 RT-qPCR檢測骨髓造血細胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin及c-myc mRNA表達

取骨髓造血細胞,按照試劑盒說明書提取總RNA,合成cDNA,進行RT-qPCR。反應體系20 μL,反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s、60 ℃退火延伸30 s,40個循環(huán)。引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參,采用2-△△Ct法分析p21、p53、GSK-3β、β-catenin及c-myc mRNA相對表達。

表1 引物序列

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 DBD對小鼠體質量的影響

如圖1所示,造模后與空白對照組相比較,模型對照組小鼠體質量呈現(xiàn)下降趨勢,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注:與空白對照組相比較▲▲P<0.01;Blank.空白對照組;Model.模型對照組;Positive.陽性對照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組

3.2 DBD對外周血參數(shù)的影響

如圖2所示,與空白對照組相比較,模型對照組白細胞(white blood cell,WBC)數(shù)、中性粒細胞(neutrophil,NETU)數(shù)、淋巴細胞(lymphocyte,LYMPH)數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與模型對照組相比較,DBD高劑量組WBC數(shù)顯著升高(P<0.05)。外周血紅細胞(red blood cell,RBC)數(shù)、血小板(platelet,PLT)數(shù)、血紅蛋白(haemoglobin,HGB)濃度各組均無明顯差異(P>0.05)。

注:與空白對照組相比較▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對照組相比較★P<0.05;與陽性對照組相比較#P<0.05,##P<0.01;白細胞 (WBC);中性粒細胞 (NETU);淋巴細胞 (LYMPH);紅細胞 (RBC);血小板 (PLT);血紅蛋白 (HGB) ;Blank.空白對照組;Model.模型對照組;Positive.陽性對照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組

3.3 DBD對脾、肝、胸腺器官指數(shù)的影響

如圖3所示,與空白對照組相比較,模型對照組脾、胸腺器官指數(shù)均顯著降低(P<0.01),肝器官指數(shù)顯著升高(P<0.01)。與模型對照組相比較,DBD各劑量組脾器官指數(shù)均顯著升高(P<0.05),肝器官指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

3.4 DBD對骨髓造血細胞SA-β-Gal含量的影響

如圖4所示,與空白對照組相比較,模型對照組SA-β-Gal含量顯著升高(P<0.01)。與模型對照組相比較,DBD中、高劑量組SA-β-Gal含量均顯著降低(P<0.05)。

注:與空白對照組相比較▲▲P<0.01;與模型對照組相比較★P<0.05,★★P<0.01;與陽性對照組相相比較##P<0.01;SA-β-半乳糖苷酶SA-β-galactosidase(SA-β-Gal);Blank.空白對照組;Model.模型對照組;Positive.陽性對照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組

3.5 DBD對髂骨造血組織的影響

如圖5所示,空白對照組骨髓造血細胞數(shù)量多,造血組織結構緊密,無核血細胞幾乎不可見;模型對照組骨髓造血細胞數(shù)明顯減少,造血組織間隙較大,無核血細胞數(shù)目增多;與模型對照組相比較,DBD各劑量組、陽性對照組骨髓造血細胞數(shù)目均明顯增多,造血組織間隙明顯減小,無核血細胞數(shù)目減小。

注:與空白對照組比較▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對照組比較★P<0.05,★★P<0.01;黑色箭頭是指髂骨中空腔部分,綠色箭頭是指骨髓中骨髓造血細胞,紅色箭頭是指無核血細胞

3.6 DBD對骨髓造血細胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表達的影響

如圖6所示,與空白對照組相比較,模型對照組β-catenin、p53、p21蛋白表達均顯著上調(P<0.05)。與模型對照組相比較,DBD高劑量組β-catenin、p53、p21蛋白表達均顯著下調(P<0.05);DBD中劑量組β-catenin表達顯著下調(P<0.05)。GSK-3β表達各組無明顯變化(P>0.05)。

注:與空白對照組比較▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對照組比較★P<0.05,★★P<0.01;Blank.空白對照組;Model.模型對照組;Positive.陽性對照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組A.分子蛋白表達圖;B.蛋白表達水平比較圖

3.7 DBD對骨髓造血細胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin、c-myc mRNA表達的影響

如圖7所示,與空白對照組相比較,模型對照組p21、p53、β-catenin、c-myc mRNA表達均顯著上調(P<0.05)。與模型對照組相比較,DBD高劑量組p21、p53、β-catenin mRNA表達均顯著下調(P<0.05),GSK-3β mRNA表達顯著上調(P<0.01);DBD低劑量組β-catenin mRNA表達顯著下調(P<0.01),GSK-3β mRNA表達顯著上調(P<0.05)。

注:與空白對照組比較▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對照組比較★P<0.05,★★P<0.01;Blank.空白對照組;Model.模型對照組;Positive.陽性對照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組

4 討論

從中醫(yī)病因角度來看,化療藥物屬于外來的“毒邪”,因此惡性腫瘤患者在接受化療治療時,外來的“毒邪”就會侵入機體。從中醫(yī)角度認為腫瘤患者正氣不足,因此毒邪侵入后,機體功能就會受到“毒邪”干擾而發(fā)生紊亂,最終嚴重影響人體氣血化生,引起臟腑功能失調。在化療藥誘發(fā)的眾多不良反應中,以骨髓抑制為主要表現(xiàn)的血液毒性最為常見。骨髓抑制患者臨床常見面色蒼白、頭目眩暈、神疲倦怠、乏力氣短、心慌失眠等癥狀,中醫(yī)病機主要為氣血兩虛,臨床常采用DBD作為治療基礎方[12]。DBD出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》,方中黃芪與當歸比為5:1,現(xiàn)代藥理研究證明按照這一比例配制出的方劑藥效最佳[13]。

依據(jù)骨髓抑制的病因病機,治療上應首先從補氣血入手,同時還應調治與氣血生成密切相關的臟腑,養(yǎng)先天而助后天,扶正氣而生精血,以使氣血化生有源。中醫(yī)認為“氣生血”,現(xiàn)代醫(yī)學研究認為各類血細胞由造血細胞分化增殖而來,中醫(yī)基礎理論中提到的“氣”可以認為對于造血細胞具有保護作用。造血細胞衰老是骨髓抑制的主要機制[4, 14]。造血干細胞是機體造血系統(tǒng)中所有血細胞的來源,具有自我更新、多向分化及長期造血重建功能[15]。有研究表明急性白血病化療后復發(fā)小鼠體內(nèi)造血干細胞的正常造血重建功能受損,而這種損傷可能是因過度增殖誘發(fā)的細胞衰老所致[16]。造血干細胞衰老的機制目前仍不明確。現(xiàn)有研究表明其機制包括 DNA 損傷、端粒縮短、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高、表觀遺傳修飾、細胞極性改變、代謝及造血微環(huán)境等幾方面[7, 17]。本研究顯示,環(huán)磷酰胺注射后小鼠外周血WBC、NETU、LYMPH顯著下降,脾、胸腺器官指數(shù)顯著降低,髂骨骨髓中造血細胞數(shù)明顯減少,造血組織間隙較大,說明化療藥可損傷骨髓造血組織,進而降低機體免疫功能。此外,SA-β-Gal作為細胞衰老標志性的酶類物質,化療藥還明顯增加了小鼠骨髓造血細胞中SA-β-Gal含量,p53/p21途徑是一條經(jīng)典的衰老相關途徑,上調p53和p21基因及蛋白的表達,提示化療藥可引起骨髓造血細胞衰老,并影響與細胞衰老相關的p53/ p21途徑。采用DBD防治后,小鼠外周血WBC顯著上升,脾器官指數(shù)顯著升高,骨髓中造血細胞數(shù)明顯增加,空腔明顯減少,說明DBD可保護骨髓造血組織,提高機體免疫功能。此外,DBD組骨髓造血細胞中衰老相關的SA-β- Gal含量顯著降低且與衰老相關p53和p21基因和蛋白的表達降低,此二個指標提示DBD對于防治骨髓造血細胞的衰老發(fā)揮了作用。

Wnt/β-catenin 信號通路可以調節(jié)造血微環(huán)境而引起造血干細胞衰老,并參與干細胞增殖、凋亡等生命過程[8]。β-catenin為Wnt/β-catenin信號通路的核心蛋白[18],GSK-3β蛋白可通過促進β-catenin N端的Ser/Thr磷酸化而使β-catenin降解[19],從而調節(jié)β-catenin的細胞內(nèi)含量。根據(jù)相關研究表明:DBD中共有兩味中藥,其中當歸中的當歸多糖影響Wnt信號通路上中下游并且當歸多糖可以通過Wnt信號通路來延緩衰老模型大鼠造血干細胞的衰老情況[20-21],另一項研究中提出當歸多糖可以下調Wnt通路中β-catenin、Wnt 4a、GSK-3β、MMP-13和ADAMTS4的表達[22];黃芪中的黃芪多糖能夠通過上調β-catenin基因、下調Axin-1基因的表達影響Wnt通路[23];黃芪甲苷能夠上調腦缺血再灌注損傷模型中 Wnt 家族重要蛋白 Wnt3a 及下游β-catenin的表達,同時通過提高BNDF和TCF-4蛋白水平影響HepG-2細胞的增殖和凋亡[24-25];黃芪總黃酮下調強直性脊柱炎模型中Wnt1和β-catenin蛋白的表達[26];黃芪總皂苷通過上調Wnt通路上游蛋白 Wnt3/3a和樞紐蛋白 β- catenin ,上調下游促分化靶向蛋白 Ngn1的表達影響Wnt通路[27]。研究DBD對于β-catenin蛋白的影響是研究Wnt通路的關鍵,本次研究中β- catenin蛋白模型對照組表達明顯上升說明此模型中Wnt通路被激活,DBD高劑量組的β- catenin基因和蛋白表達下調以及GSK-3βmRNA表達上調都提示該劑量的DBD對于此通路起到了抑制作用。

綜上所述,本次研究說明DBD對于防治化療后骨髓造血細胞的衰老有明顯的作用,為探究DBD防治化療后骨髓造血細胞衰老的機制提供了研究結果和思路,其中DBD高劑量組的藥效結果最好。提示臨床上對于需要放化療的患者可以提前服用并適當增加DBD的劑量以保護骨髓造血細胞,對于放化療后引起的骨髓抑制貧血的副作用進行預防。