基于網絡藥理學和生物信息學探討并驗證槲皮素治療肝癌的靶點和機制?

柳 卓,譚小寧,翦慧穎,曾普華,

(1.長沙醫學院,長沙 410219;2.湖南省中醫研究院,長沙 410006;3.湖南省中醫藥研究院附屬醫院,長沙 410006)

世界衛生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, ARC)發布了2021年全球最新癌癥數據,全世界被確診為肝癌的人超過90萬,肝癌死亡的人超過83萬,死亡人數接近發病人數。2021年中國有超過41萬人新患肝癌,超過39萬人死于肝癌[1]。肝癌的致病原因目前主要認為是乙型和丙型肝炎病毒、非酒精脂肪性肝病、長期酗酒、進食黃曲霉毒素等導致[2]。目前肝癌治療方法有手術療法、放化療、肝移植、介入及藥物治療等。但肝癌的治療和預后相對較差,副作用較多且費用也較高。因此,找到治療效果確切且毒副作用較小的輔助藥物為研究熱點[3]。

中醫藥對肝癌的治療是我國肝癌患者重要的治療手段之一,許多中藥提取物都顯示出對肝癌有抑制作用,從中藥成分或植物來源中找到的一些天然化合物既能保護正常細胞不受影響,又能對癌細胞有殺傷力,但目前中藥成分藥理機制仍然不明確。槲皮素是廣泛存在于中藥中的天然黃酮類化合物,被認為是一種有效的癌癥治療劑和抗氧化劑,同時也是腫瘤治療劑和自噬介質,已經被證明能通過多種途徑治療肝癌、肺癌等不同惡性腫瘤[4]。近年來,有體外試驗已表明槲皮素對肝癌細胞凋亡和細胞周期有阻滯作用,并具有抑制腫瘤轉移、抗血管生成、化療增敏作用、調節肝臟脂質代謝、增強抗炎作用,并呈現濃度和時間依賴性[5]。在體內實驗表明槲皮素能逆轉癌前病變[6]。目前,針對槲皮素治療肝癌的研究雖在不斷深入,但仍無針對其有效的具體分子機制研究。因此,本文基于網絡藥理學和生物信息學,對槲皮素治療肝癌的分子靶點及通路進行預測及分子對接進行驗證,為槲皮素對肝癌研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 HepG2細胞為湖南省中醫藥研究院附屬醫院中心實驗室惠贈。Hep3B細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司(貨號CL-0102)。HuH-7細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司(貨號CL-0120)。

1.1.2 試劑 DMEM培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司(貨號PM15210);電致化學發光(electrochemiluminescence,ECL)發光液購自白鯊生物科技有限公司(貨號BL520B);醛糖還原酶(aldoketo reductase family 1 member B1,AKR1B1)一抗購自安諾倫(北京)生物科技有限公司(貨號GTX113381);胎牛血清購自美國Gibco公司(批號 A316081);槲皮素購自南京景竹生物科技有限公司(貨號117395)。

1.1.3 儀器 SW-CJ-2F型超凈工作臺,蘇州安泰公司);TG16-WS型高速離心機,湖南賽特湘儀公司;OPERETTA型高內涵成像分析系統,美國PerkinElmer公司;EIX808U型酶標儀,美國BioTek公司;Min-PROTEAN Tetra電泳儀,美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 收集和處理槲皮素靶點 使用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集槲皮素的成分信息。并從Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找的槲皮素3D結構導入到PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)中預測分子靶點。將化合物預測產生的靶點進行重復性的篩選剔除,結合臨床試驗文獻報道補充槲皮素的靶點,并將其錄入UniPtot(https://www.uniprot.org/)剔除非人源的靶點。

1.2.2 肝癌疾病相關靶點及槲皮素與肝癌相關靶點收集 通過GeneCards(https://www. genecards. org/)、OMIM(https://omim.org/)和TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)搜索肝癌相關靶點,篩選并刪除重復的靶點,并利用Ri386 4.0.5軟件找出1.2.1收集的槲皮素作用于肝癌的作用靶點。

1.2.3 網絡調控靶點分析 將槲皮素作用肝癌的關鍵靶點信息輸入String11.0(https://www.string-db.org/)數據庫構建蛋白質相互作用網絡,得到蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction network, PPI),并將信息輸入Cytoscape 3.6.2進行網絡分析,得出平均最短路徑、聚類系數、度值等。

1.2.4 槲皮素調控肝癌相關通路分析 采用Ri386 4.0.5軟件、Cytoscape 3.6.2軟件的app GlueGO插件及DAVID 6.8,對槲皮素對肝癌作用關鍵靶點的GO和KEGG進行分析,選取閾值P小于0.05的靶點,并根據P值從小到大篩選。從基因靶點的分子功能(molecular function,MF)、參與生物過程(biological process,BP)和細胞成分(cell components,CC)三個方面進行分析,利用R語言下載“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”數據包進行交叉靶點KEGG路徑富集分析綜合預測槲皮素與肝癌關鍵調控通路。

1.2.5 分子對接結果分析

1.2.5.1 分子對接結果 將找出的所有槲皮素對肝癌的作用靶點共76個,去除掉非人源性基因和不能結合的基因,剩余70個,在PDB(https://www1.rcsb.org/)分別搜索70個靶點蛋白保存為PDB格式。將70個藥物-疾病關鍵靶點分別與配體槲皮素(MOL2格式)用iGEMDOCK分子對接軟件進行分子對接,參數均采用默認參數。

1.2.5.2 系統分子對接結果 將槲皮素治療肝癌的70個作用靶點的PDB ID輸入Systemsdock數據庫,找出活性位點,用ChemBio3D 軟件保存槲皮素mol2 3D 結構,輸入應用AutoDockVina開始對接整理結果并分析得到系統分子對接結果。

1.2.6 槲皮素對人肝癌細胞的作用驗證

1.2.6.1 細胞培養 HepG2和Huh-7在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養,Hep3B細胞在含有10%胎牛血清的MEM培養基中培養。并放在37 ℃、5%CO2和飽和濕度的細胞培養箱中。

1.2.6.2 分組和給藥 取1×106對數長期HepG2、Huh-7、Hep3B,分別設對照組、陽性組(順鉑20 μg/mL)和槲皮素組100 μmol/L,每組設置6個復孔。各組均接受藥物干預24 h。

1.2.6.3 CCK8檢測槲皮素的抑制作用 首先取50、100、150、200、250 μmol/L五個濃度梯度對HepG2細胞進行24 h的干預,按照CCK8試劑盒方法檢測其光密度(optical density,OD)值。

取20、50、100 μmol/L三個不同濃度梯度槲皮素分別干預HepG2、Huh-7、Hep3B培養24 h后,棄掉上清,每孔加入CCK8,37 ℃培養2 h,于450 nm波長處,用酶標儀測定各孔吸光值(OD值)。

1.2.6.4 測定各組細胞腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β 對數成長期HepG2細胞,以5×102個接種于6孔板,各組藥物干預24 h后,采用ELISA法檢測細胞上清液TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.2.6.5 Western blot檢測 取HepG2細胞,各組藥物處理24 h后,提取蛋白,取含有100 μg總蛋白的細胞裂解產物進行電泳,5%脫脂奶粉進行封閉1 h,加入稀釋一抗AKR1B1(1:1 000)4 ℃孵育過夜,清洗后二抗搖床孵育2 h,清洗后用凝膠成像[7]。

1.2.6.6 高內涵(high content screening, HCS)檢測AKR1B1蛋白表達量 取黑色96孔板接種細胞,4組加入相應藥物,干預24 h。4%多聚甲醛固定30 min,棄液,磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)清洗5 min,重復3次。Trition-100處理15 min,提前冷藏PBS洗3次。5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉30 min。分別加入(1∶100)兔抗小鼠AKR1B1一抗稀釋液避光4 ℃過夜孵育,冷PBS洗3次,加入(1∶200)FITC標記的山羊抗兔二抗稀釋液避光37 ℃ 30 min孵育,加入DAPI染核,避光室溫20 min孵育,每孔加入50 μL PBS,于高內涵成像分析系統上進行熒光檢測并拍照[8]。

2 結果

2.1 槲皮素的化學結構及靶點信息

根據文獻和數據庫PharmMapper得到槲皮素已報道的靶點共325個,通過Uniprot數據庫刪選不重復的靶點共299個,包括HSP82、syd、Nup214、ALB、PKLR等,度值最高的為ALB,其次為PKLR。槲皮素的化學2D和3D結構見圖1,其結構以色酮為基本結構并包含五個酚羥基,分子排列緊密引力較大,不易溶解限制了其在動物體內的生物利用度。

圖1 槲皮素的結構

2.2 肝癌相關靶點數據構建及比對分析

在GeneCards、OMIM、TTD數據庫共刪選出了24395個疾病基因,將三個數據庫去重后共得到17359個疾病基因,GeneCards選擇分數>40的數據,共篩選出214個靶點。對槲皮素靶點與肝癌的相關發病機制靶點進行比對后得到共76個作用靶點基因,除去重復的基因后得到70個靶點基因,利用Cytoscape 3.6.2繪制槲皮素對肝癌作用靶點的互作網絡關系圖,見圖2,將槲皮素治療肝癌的潛在70個作用靶點和疾病靶點通過Ri386 4.0.5得出韋恩圖,疾病靶點比較表現出潛在的70個作用靶點均在肝癌的靶點內,見圖3。將70個作用靶點輸入到String數據庫去除掉無相互作用的靶點后導出PPI圖。得到槲皮素對肝癌的作用靶點共有72個節點,平均聚類系數為0.598,共有538個邊數,平均度數為14.2,見圖4。根據R語言matrix算法分析在string中槲皮素與肝癌靶點基因數據得出較相關的基因有IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA、MYS、CCND1、ERBB2、FOS、AR、PPARG、RELA、CASP8、HIF1A、NOS3、ICAM1、PTGS1等,其中IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA等靶點數較多,見圖 5,槲皮素對肝癌作用靶點的拓撲學分析見表1,包括了最短路徑、介數、中心接近度、聚類系數、度數等。

表1 槲皮素治療肝癌靶點拓撲分析(度值前30個靶點)

圖2 槲皮素治療肝癌作用靶點的蛋白質相互作用網絡關系

圖3 槲皮素治療肝癌作用靶點的韋恩圖

圖4 槲皮素治療肝癌靶點PPI圖

圖5 槲皮素治療肝癌影響相關基因統計

2.3 槲皮素治療肝癌靶點的GO和KEGG分析

經R語言及David數據庫對核心靶點進行GO分析,見圖6、表2,并將前10位的CC、MF、BP篩選出來,包括GO分組編號及P值。GO分析共得到33個CC,P值靠前的有胞漿、細胞外間隙、細胞質、膜筏、核質等;63個MF,P值靠前的有酶結合、相同蛋白結合、轉錄因子結合、蛋白質結合、蛋白質異二聚活性等;353個BP,P值靠前的有RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控凋亡過程的負調控、凋亡過程的負調控、對雌二醇的反應、細胞對缺氧的反應等。

圖6 槲皮素治療肝癌靶點GO圖

將槲皮素治療肝癌的靶點用David數據庫及R語言進行KEGG信號分析,共包含72條通路,根據P值篩選出前7條,見圖7,將通路名稱、相關基因及P值匯總到表3,氣泡圖顯示氣泡越大基因個數越多,氣泡越藍,P值越小,顯著性越高。主要包括癌癥相關途徑、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、凋亡、低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、p53信號通路等,在肝癌發病機制中均有報道,可見GO和KEGG方法是可行的,結果顯示對槲皮素對通過這些通路對肝癌起效[9-11]。

表3 槲皮素治療肝癌靶點KEGG分析

圖7 槲皮素治療肝癌靶點的KEGG氣泡圖

2.4 槲皮素-肝癌作用靶點分子對接結果分析

2.4.1 分子對接結果 將肝癌的70個潛在靶點分別與槲皮素進行分子對接,結合能量越低時配體與受體結構越穩定,選出結合能力最強的前5個分子,其中分子對接結合能力較強的有AKR1B1、NQO1、NOS3、CYP3A4、RASSF1,結合能力最強的為AKR1B1、其次是NQO1,見表4。

表4 槲皮素治療肝癌分子對接結果

2.4.2 系統分子對接結果 槲皮素對肝癌對接結果表示槲皮素與MYC、STAT3、EGFR、MAPK1、CASP3、VEGFA等21個靶點的系統對接分值大于5,表明槲皮素與肝癌的作用靶點有較好的結合活性,將靶點名稱、PDB編號、系統對接得分、分子對接得分總結見表5。綜合結合能力最好的是AKR1B1、NQO1、NOS3、CYP3A4、RASSF1。由此可見基因AKR1B1可能在槲皮素治療肝癌中有重要的作用。

表5 槲皮素治療肝癌的分子對接分數

2.5 槲皮素對人肝癌細胞的作用

2.5.1 不同濃度槲皮素對人肝癌細胞的抑制率 槲皮素對HepG2細胞CCK8結果表示,其對肝癌細胞有抑制作用,并隨著其濃度的增加,增值抑制作用逐漸增強,細胞數變少。IC50=98.54 μmol/L,見圖8。

注:半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)

與對照組比較,不同濃度槲皮素組和順鉑組干預HepG2、Huh-7、Hep3B細胞后,增殖下降,并且濃度越高,抑制能力越強,并具有統計學意義(P<0.05),見表6。

表6 不同濃度槲皮素分別干預三種肝癌細胞24h后增殖影響

2.5.2 槲皮素干預HepG2細胞后TNF-α、IL-6、IL-1β濃度 與對照組比較,槲皮素和順鉑組TNF-α、IL-6、IL-1β表達顯著降低(P<0.05),可見,槲皮素能降低腫瘤細胞的炎癥因子的表達量,驗證了槲皮素治療肝癌與炎癥因子有關,見表7。

表7 各組細胞TNF-α、IL-6、IL-1β濃度

2.5.3 槲皮素干預HepG2細胞后AKR1B1表達實驗結果 通過Western blot實驗,發現槲皮素組和陽性藥物組中AKR1B1的表達明顯低于對照組,并具有統計學意義(P<0.05)。槲皮素的表達低于陽性藥物組,無統計學意義,見圖9、表8。

表8 Western blot檢測槲皮素干預HepG2細胞后AKR1B1的蛋白表達

注:醛糖還原酶(AKR1B1)A.對照組;B.槲皮素;C.順鉑組。

2.5.4 HCS檢測HepG2細胞的AKR1B1實驗結果 HCS實驗(圖10、表9)發現槲皮素組和陽性藥物組中AKR1B1的表達明顯低于對照組,并具有統計學意義(P<0.05)。槲皮素的表達低于陽性藥物組,差異無統計學意義。由此可見,槲皮素對肝癌的作用可能與AKR1B1有關。

表9 高內涵(HCS)細胞成像分析系統檢測醛糖還原酶(AKR1B1)在HepG2中的蛋白表達

注:醛糖還原酶(AKR1B1)A.對照組;B.槲皮素;C.順鉑組

3 討論

肝癌是全世界第五大最常見癌癥和第三大癌癥死亡原因。現在肝癌的治療主要是以手術為主,但術后的高復發率始終影響著患者的生活和生存發展。中藥存在作用靶點多、成分較多的特點,現代研究表明,中藥抗肝癌具有明顯的作用[12-13]。槲寄生總堿能通過造成細胞內鈣超載引起肝癌細胞凋亡[14]。槲皮素廣泛分布于被子植物的中藥中,已有體內體外及臨床研究均表明其具有誘導腫瘤細胞凋亡及抑制生長的作用,但其機制仍然不完全明確[4]。現代藥理研究表明,槲皮素能增加E-cadherin蛋白的表達使得抑制轉化生長因子 (transforming growth factor,TGF) -β1誘導肝癌細胞EMT得到抑制[15]。Ren[5]研究表明槲皮素納米粒通過滅活凋亡相關的caspase通路,抑制炎癥因子而具有抗腫瘤作用。但仍不能系統揭示槲皮素治療肝癌的關鍵靶點機制。由于槲皮素不穩定并且溶解性差,限制了臨床使用,現在有研究將槲皮素和納米顆粒結合可以通過多靶點作用有效地抑制肝癌細胞增殖、細胞遷移和集落形成從而提高其療效并減少副作用[5]。

本研究通過化合物數據庫找出槲皮素對肝癌相關靶點76個,篩選出70個。GO分析表明槲皮素抗肝癌細胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)相關信號及凋亡作用的靶點有原癌基因(MYC)、醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase,NQO)1等。KEGG分析表明槲皮素治療肝癌的關鍵靶點主要是通過癌癥相關通路、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、凋亡、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。因此,槲皮素可通過以上幾種方式來發揮治療肝癌的作用。KEGG分析發現除了癌癥相關通路外,炎癥細胞因子也有很大的相關性。

從分子對接的結果中分析,共有21個關鍵靶點系統對接分值大于5,其與MYC、信號轉導和轉錄激活因子 (signal transducer and activator of transcription,STAT)3、表皮生長因子受體(epidermal growth factor recptor,EGFR)、MAPK1、人胱天蛋白酶3(caspase 3,CASP3)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)結合活性較好。而結合能力最好的是AKR1B1、NQO1、內皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)3、細胞色素P450(cytochrom P450,CYP)3A4酶、Ras關聯域家族(ras association domain family,RASSF)1。可見AKR1B1基因可能在槲皮素治療肝癌中起重要作用。在體外研究表明,槲皮素組和陽性藥物組AKR1B1的表達明顯低于空白對照組。槲皮素的表達低于陽性藥物組,炎癥相關因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達降低。可見,槲皮素可能與AKR1B1結合后有抗癌作用,其機制可能與炎癥有關。

綜上,通過網絡藥理學和生物信息學技術,輔助實驗驗證,探討槲皮素在治療肝癌的過程中的分子機制及其潛在靶點,更深入地研究了有效成分—靶點—疾病的相互作用,為肝癌的中醫藥治療提供了新藥研制方向及機制研究思路。但由于數據庫資料的不全面,使得本研究具有一定的局限性。因此接下來將對槲皮素治療肝癌的基礎機制進行更深入的驗證和探討。