柴胡桂枝湯加減通過調節Wnt／β-catenin 信號通路對骨質疏松大鼠的改善作用及機制研究

郭中華，史棟梁，曹玉舉，王云飛，楊少祥，秦合偉，張仲博，任博文，周松林，王俊杰，王莉莎，萬小冠

（1.河南省中醫院骨病一科，鄭州 450053；2.鄭州中醫骨傷病醫院骨科，鄭州 450016；3.河南省中醫院康復科，鄭州 450053；4.河南省中醫院疼痛科，鄭州 450053；5.鄭州市第九人民醫院骨科，鄭州 450053）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種全身性多因素骨骼疾病，其特征是骨量減少、骨微結構破壞和骨脆性增加［1－2］。 隨著人口老齡化程度的擴大，OP 的患病率不斷上升，已成為許多國家的重要公共衛生問題［3－4］。 目前，OP 的治療主要采用藥物療法、物理療法和運動療法。 盡管OP 的治療取得了很大進展，但治療效果仍不能達到臨床預期，如許多新開發的抗OP 藥物價格昂貴，限制了其廣泛的臨床應用，藥物不良反應最終影響患者服藥依從性等［5］。 因此開發新的治療OP 的藥物變得非常重要。 柴胡桂枝湯出自張仲景《傷寒論》，已有研究顯示其在臨床上治療類風濕關節炎方面療效顯著［6］。但關于柴胡桂枝湯能否改善OP 尚不清楚。 最近的研究顯示，激活Wnt／β-連環蛋白（β-catenin）信號通路可延緩OP 的發生和發展［7］。 而柴胡桂枝湯能否通過調節Wnt／β-catenin 信號通路改善OP 尚不明確。 因此，本研究嚴格參考臨床相關研究［8］在柴胡桂枝湯原方的基礎上通過加減一些藥物合為柴胡桂枝湯加減（Chaihu Guizhi Decoction，CGD），觀察CGD 對OP 大鼠的影響并探究相應的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

84 只SPF 級雌性SD 大鼠（7 周齡，體重200 ～210 g）購于廣東南模生物公司［SCXK（粵）2022－0062］，飼養于河南省中醫院SPF 級實驗室［SYXK（豫）2021－0018］。 本研究遵循3R 原則，且所有動物實驗都已獲得河南省中醫院動物倫理委員會的審核及批準（HNSZYY2022010012）。

1.2 主要試劑與儀器

CGD 由黃芩10 g、葛根30 g、黨參10 g、桂枝15 g、柴胡24 g、生姜10 g、白芍15 g、清半夏12 g、炙甘草10 g、焦神曲10 g、白術20 g、大棗10 g 組成，購于河南省中醫院中藥房。 加入5 倍藥材質量的水浸泡藥材2 h，大火燒開后轉文火煮1 h，經過濾得煎液，重新加水再煎煮第2 次。 將兩次所得的煎煮液混合并加熱濃縮至5 g／mL。

維甲酸（規格50 mg，批號：20211128）購自深圳振強生物公司；戊酸雌二醇（estradiol valerate，EV）（批號：20220213）購自北京凱詩源生物公司；Wnt／β-catenin 通路抑制劑DKK-1（批號：20211218）購自上海禾午生物公司；大鼠Ⅰ型膠原C 端肽（Ctelopeptide of type Ⅰ collagen，CTX-Ⅰ）、骨 鈣 素（osteocalcin，BGP）ELISA 試劑盒（批號：20211123、20220706）購自上海鈺博生物公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）鈣－鈷染色試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號：20220704、20220619）購自上海歌凡生物公司；兔源一抗Wnt3a、β-catenin、GAPDH 和二抗（批號：ab219412、ab32572、ab8245、ab97051）均購自英國Abcam 公司。 SktScan 1176 micro-CT 儀購自德國Bruker 公司；BX53 光學顯微鏡購自日本奧林巴斯；DYY-7C 型蛋白電泳儀購于北京六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及OP 模型的構建

將84 只SD 大鼠隨機分為Model 組、CK 組、高劑量CGD 組（CGD-H 組）、低劑量CGD 組（CGD-L組）、戊酸雌二醇組（EV 組）、Wnt／β-catenin 通路抑制劑（DKK-1）組和CGD-H＋DKK-1 組，每組12 只。除CK 組外，其他組大鼠均通過灌胃70 mg／kg 維甲酸的方式（每天1 次，持續4 周）構建OP 大鼠模型［9］。 CK 組大鼠在相同時間段內灌胃等量的生理鹽水。 通過觀察股骨微觀結構以及股骨病理損傷來判斷造模是否成功。 造模成功后，根據參考文獻及前期預實驗結果進行給藥處理，CGD-L 組、CGDH 組、EV 組［10］大鼠分別需灌胃5 g／kg CGD、20 g／kg CGD、9 mg／kg EV，且均需腹腔注射等量的生理鹽水；DKK-1 組［11］大 鼠 需 腹 腔 注 射100 mg／kg DKK-1 且灌胃等量的生理鹽水；CGD-H＋DKK-1 組大鼠在灌胃20 g／kg CGD 的同時還需腹腔注射100 mg／kg DKK-1；Model 組、CK 組大鼠均需灌胃及腹腔注射等量的生理鹽水，每天給藥1 次，給藥共持續4 周。

1.3.2 標本收集

末次給藥24 h 后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉所有大鼠，尾靜脈取血（離心收集血清）用于CTX-Ⅰ、BGP 的檢測；處死大鼠并收集其左右兩側的股骨組織，利用micro-CT 儀檢測左側股骨微觀結構相關指標骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量的變化；將大鼠右側股骨組織，分為兩部分，一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE、ALP 鈣－鈷、TRAP 染色，另一部分凍存于－80℃中用于Western blot 實驗。

1.3.3 ELISA 法檢測血清中CTX-Ⅰ、BGP 水平

按照試劑盒說明檢測血清中CTX-Ⅰ、BGP水平。

1.3.4 股骨微觀結構相關指標的檢測

取各組大鼠左側股骨固定于10%福爾馬林溶液中，利用micro-CT 儀平掃大鼠左側股骨，掃描參數設置為：管電壓50 kV，管電流400 μA，分辨率10 μm，曝光時間300 ms，掃描角度360°。 使用Med Project 4.1 和Micro View 軟件對大鼠左側股骨二維圖像生成三維渲染，并自動計算骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量的變化。

1.3.5 HE 染色檢測大鼠股骨病理變化

將固定于4%多聚甲醛中的股骨組織脫鈣、包埋、切片（5 μm 厚）、HE 染色后，觀察股骨病理變化。

1.3.6 ALP 鈣－鈷染色檢測大鼠股骨中成骨細胞活性

取1.3.5 中的組織切片，經脫蠟后，用ALP 孵育液孵育12 h，自來水沖洗；加入硝酸鈷孵育5 min，自來水沖洗；加入硫化工作液孵育2 min，自來水沖洗；核固紅染色，自來水沖洗；將切片脫水、透明、封片。 利用光學顯微鏡觀察細胞質內深褐色沉淀形成情況，褐色沉淀形成越多，表明成骨細胞活性越高。

1.3.7 TRAP 染色檢測大鼠股骨組織中破骨細胞活性

取1.3.5 中的組織切片，經脫蠟后，用TRAP 固定液固定1 min，自來水沖洗；TRAP 孵育液孵育1 h，自來水沖洗；蘇木素染液染色7 min，自來水沖洗；將切片脫水、透明、封片。 利用光學顯微鏡觀察細胞質內紫紅色沉淀形成情況，紫紅色沉淀形成越多，表明破骨細胞活性越高。

1.3.8 Western blot 檢測各組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白

用RIPA 裂解緩沖液提取股骨組織總蛋白，提取的蛋白經定量、電泳、轉膜、封閉后，在4℃下將膜分別與一抗Wnt3a（1 ∶1000）、β-catenin（1 ∶2000）、GAPDH（1 ∶1000）過夜孵育。 次日，將膜與二抗（1∶2000）共同孵育2 h。 ECL 試劑用于蛋白印跡觀察，ImagePro Plus 軟件評估條帶強度。

1.4 統計學方法

使用GraphPad Prism 8 進行數據分析，所有數據均以平均數±標準差（±s）表示，各組數據均符合正態且方差齊。 單因素方差分析多組間的差異，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CGD 對大鼠血清中CTX-Ⅰ、BGP 水平的影響

與CK 組比較，Model 組大鼠血清中CTX-Ⅰ水平升高，BGP 水平降低（P＜0.05）；與Model 組相比，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠血清中CTX-Ⅰ水平降低，BGP 水平升高，DKK-1 組大鼠血清中CTX-Ⅰ水平升高，BGP 水平降低（P＜0.05）；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠血清中CTX-Ⅰ水平升高，BGP 水平降低（P＜0.05）。 見表1。

表1 CGD 對各組大鼠血清中CTX-Ⅰ、BGP水平的影響（±s，n＝12）Table 1 Effect of CGD on serum CTX-Ⅰand BGP levels of rats in each group

表1 CGD 對各組大鼠血清中CTX-Ⅰ、BGP水平的影響（±s，n＝12）Table 1 Effect of CGD on serum CTX-Ⅰand BGP levels of rats in each group

注：與CK 組比較， *P＜0.05；與Model 組比較， ＃P＜0.05；與CGD-L組比較， △P＜0.05；與CGD-H 組比較， ▲P＜0.05。Note.Compared with CK group， *P ＜0.05.Compared with Model group， ＃P＜0.05.Compared with CGD-L group， △P＜0.05.Compared with CGD-H group， ▲P＜0.05.

組別Groups CTX-Ⅰ（ng／mL） BGP（ng／mL）CK 12.25±1.03 13.75±1.01 Model 28.74±1.75* 6.28±0.17*CGD-L 23.45±1.61＃ 8.25±0.28＃CGD-H 14.46±0.98＃△ 12.31±0.69＃△EV 14.57±1.05＃△ 12.51±0.76＃△DKK-1 35.56±1.73＃ 3.69±0.22＃CGD-H＋DKK-1 20.32±1.77▲ 9.32±0.45▲

2.2 CGD 對大鼠股骨微觀結構的影響

與CK 組比較，Model 組大鼠股骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量降低（P＜0.05）；與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠股骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量升高，DKK-1 組大鼠股骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量降低（P＜0.05）；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量降低（P＜0.05）。 見圖1和表2。

圖1 Micro-CT 儀檢測大鼠股骨微觀結構Figure 1 Micro-CT apparatus for detecting the microstructure of rat femur

表2 CGD 對各組大鼠股骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量的影響（±s，n＝12）Table 2 Effect of CGD on femoral bone volume fraction， trabecular thickness， bone density and trabecular number of rats in each group

表2 CGD 對各組大鼠股骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量的影響（±s，n＝12）Table 2 Effect of CGD on femoral bone volume fraction， trabecular thickness， bone density and trabecular number of rats in each group

注：與CK 組比較， *P＜0.05；與Model 組比較， ＃P＜0.05；與CGD-L 組比較， △P＜0.05；與CGD-H 組比較， ▲P＜0.05。Note.Compared with CK group， *P＜0.05.Compared with Model group， ＃P＜0.05.Compared with CGD-L group， △P＜0.05.Compared with CGD-H group， ▲P＜0.05.

組別Groups骨體積分數（%）Bone volume fraction骨小梁厚度（mm）Trabecular thickness骨密度（g／mm3）Bone density骨小梁數量（n／mm）Number of trabeculae CK 19.67±0.54 0.078±0.002 0.29±0.01 5.89±0.23 Model 9.89±0.34* 0.023±0.001* 0.12±0.01* 1.72±0.14*CGD-L 12.62±0.42＃ 0.039±0.002＃ 0.18±0.01＃ 2.32±0.15＃CGD-H 17.72±0.48＃△ 0.066±0.004＃△ 0.27±0.02＃△ 5.21±0.26＃△EV 17.81±0.50＃△ 0.068±0.003＃△ 0.26±0.01＃△ 5.24±0.27＃△DKK-1 6.31±0.27＃ 0.011±0.001＃ 0.06±0.01＃ 1.06±0.09＃CGD-H＋DKK-1 13.66±0.45▲ 0.042±0.002▲ 0.19±0.02▲ 2.94±0.20▲

2.3 CGD 對大鼠股骨病理損傷的影響

CK 組大鼠股骨組織切片呈現出豐富、連續、致密的骨小梁；Model 組大鼠股骨組織切片表現為有大的骨髓腔形成以及骨小梁數量減少，符合OP 的典型特征，見圖2。 與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠股骨病理損傷減輕，DKK-1 組大鼠股骨中形成的骨髓腔變大，骨小梁數量減少；與CGD-H 組相比，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨大的骨髓腔形成以及骨小梁數量減少的特征更加明顯。

注：箭頭所指處為骨髓腔。圖2 HE 染色檢測大鼠股骨病理變化Note.Arrow pointed to the bone marrow cavity.Figure 2 Pathological changes of rat femur detected by HE staining

2.4 CGD 對大鼠股骨組織中成骨細胞活性的影響

如圖3 所示，與CK 組相比，Model 組股骨組織中成骨細胞質內深褐色沉淀減少；與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠股骨組織中成骨細胞質內深褐色沉淀增多，DKK-1 組大鼠股骨組織中成骨細胞質內深褐色沉淀減少；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨組織中成骨細胞質內深褐色沉淀減少。

注：箭頭所指處為成骨細胞質內深褐色沉淀。圖3 ALP 鈣－鈷染色檢測大鼠股骨中成骨細胞活性Note.Arrow pointed to a dark brown deposit in the osteoblastic cytoplasm.Figure 3 Detection of osteoblast activity in rat femur by ALP calcium cobalt staining

2.5 CGD 對大鼠股骨組織中破骨細胞活性的影響

圖4 結果顯示，與CK 組比較，Model 組大鼠股骨組織中的破骨細胞質內紫紅色沉淀（箭頭所指處）明顯增多；與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H組、EV 組大鼠股骨組織中的破骨細胞質內紫紅色沉淀明顯減少，DKK-1 組大鼠股骨組織中的破骨細胞質內深褐色沉淀增多；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨組織中的破骨細胞質內深褐色沉淀增多。

注：箭頭所指處為破骨細胞質內紫紅色沉淀。圖4 TRAP 染色檢測大鼠股骨組織中破骨細胞活性Note.Arrow pointed to a purplish red deposit in the osteoclast cytoplasm.Figure 4 Detection of osteoclast activity in rat femur by TRAP staining

2.6 CGD 對大鼠股骨組織中Wnt／β-catenin 相關蛋白表達的影響

如圖5 所示，與CK 組比較，Model 組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達降低（P＜0.05）；與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達升高，DKK-1組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達降低（P＜0.05）；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達降低（P＜0.05）。

注：與CK 組比較， *P＜0.05；與Model 組比較， ＃P＜0.05；與CGD-L 組比較， △P＜0.05；與CGD-H 組比較， ▲P＜0.05。圖5 Western blot 檢測各組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白Note.Compared with CK group， *P＜0.05.Compared with Model group， ＃P＜0.05.Compared with CGD-L group， △P＜0.05.Compared with CGD-H group， ▲P＜0.05.Figure 5 Western blot detection of Wnt3a and β-catenin proteins in femoral tissue of rats in each group

3 討論

OP 是一種以礦化骨量減少為特征的疾病，在解剖學上主要表現為皮質厚度和孔隙率減少，松質骨小梁的數量和大小減少，髓質空間擴大［12］。 有研究報道，骨的生物力學能力不僅與存在的骨量有關，還與它的微觀結構（骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量等）有關［13］。 本研究通過灌胃維甲酸的方式構建OP 大鼠模型，結果顯示，Model組大鼠的股骨組織切片表現為有大的骨髓腔形成以及骨小梁數量減少，Model 組大鼠股骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數量顯著低于CK組，提示成功構建了OP 模型大鼠。 研究報道，破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成之間的不平衡導致了OP，其中，成骨細胞和破骨細胞活性的不平衡起主要作用［14］；CTX-Ⅰ是骨吸收標志物，而BGP 為骨形成的標志物，因此，血清中CTX-Ⅰ、BGP 水平可作為衡量OP 過程中骨形成的重要指標［15－16］。 本研究發現，與CK 組相比，Model 組破骨細胞活性升高、成骨細胞活性降低，血清中CTX-Ⅰ水平升高、BGP 水平降低，表明成骨細胞介導的骨形成低于破骨細胞介導的骨吸收，導致了骨量減少，進而形成了OP。

OP 屬“骨痿”范疇，中醫認為其主要病機為肝失所養、脾失健運，故主張以疏肝理氣、健脾為治療原則［17］。 CGD 在原方的基礎上通過去人參避免補益太過；加入焦神曲健脾和胃；白術健脾益氣；黨參補中益氣，合為CGD 方，以增強其疏肝和胃、健脾之功效。 目前，不同種類的的CGD 方已應用于多種疾病的研究，如CGD 可抑制三陰性乳腺癌裸鼠體內腫瘤的生長［18］；CGD 治療功能性消化不良效果顯著［19］。 而關于CGD 對OP 的影響尚未見報道。 本研究顯示，CGD 可抑制破骨細胞活性及CTX-Ⅰ水平，上調成骨細胞活性并促進BGP 表達，且CGD 劑量越高，對應的趨勢越明顯，而CGD-H 組與EV 組相比對應指標的趨勢變化差異不顯著，說明CGD 可能是通過促進成骨細胞介導的骨形成，并抑制破骨細胞介導的骨吸收來改善大鼠OP 的。 此外，盡管EV 治療OP 效果顯著，但其極易產生胃腸道反應、精神狀態不佳等副作用［20］。 提示CGD 可能成為治療OP 的潛在優良藥物。

大量研究表明，Wnt／β-catenin 通路可以刺激成骨細胞增殖和分化，在OP 進展中發揮重要作用［21］。 如二甲雙胍激活Wnt／β-catenin 通路可治療糖尿病性OP［22］；益腎健骨顆粒通過激活Wnt／β-catenin 通路促進去卵巢大鼠成骨細胞增殖而改善絕經后骨質疏松［23］。 以上研究表明激活Wnt／β-catenin 通路可以改善OP。 本研究顯示，經Wnt／β-catenin 通路抑制劑DKK-1 處理后，Model 組大鼠對成骨細胞介導的骨形成的抑制作用以及對破骨細胞介導的骨吸收的促進作用增強，表明Wnt／β-catenin 通路確實參與了OP 過程。 本研究還發現，CGD 可上調Model 組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達，且CGD 劑量越高，Wnt3a、β-catenin 蛋白表達上調趨勢越明顯，猜想CGD 改善大鼠OP 可能是通過激活Wnt／β-catenin 通路實現的。 為了驗證該猜想，本研究在高劑量CGD 處理的基礎上再用DKK-1 干預OP 大鼠，結果發現，DKK-1減弱了高劑量CGD 對大鼠OP 的改善作用。

綜上所述，CGD 可能通過激活Wnt／β-catenin通路改善大鼠OP。 該研究可能為OP 的治療提供了一個新的視角。 CGD 對大鼠OP 的改善作用可能還涉及其他通路，本研究尚未探究，這將是后續研究的重點內容之一。