ADAM10 在骨髓間充質干細胞成骨分化及脛骨骨折愈合中的作用及可能機制

唐曉旭，張志乾，李福琴，王 楠

（1.鄭州澍青醫學高等專科學校臨床醫學系，鄭州 450064；2.河南省洛陽正骨醫院脊柱外科，鄭州 457000；3.鄭州大學第一附屬醫院感染管理科，鄭州 450052；4.鄭州大學第一附屬醫院急診外科，鄭州 450052）

脛骨骨折是臨床常見的四肢骨折類型，多由高能量暴力引起，容易造成局部軟組織及血供的破壞，進而增加內固定手術后骨折不愈合或延遲愈合的發生風險［1－2］。 骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在骨折愈合過程中發揮重要作用，骨折斷端趨化和浸潤的BMSCs 能夠發生成骨分化，進而促進骨質形成、加速骨折愈合［3］；BMSCs 的浸潤及成骨分化受阻時，對骨折愈合產生不利影響［4］。 BMSCs 成骨分化的影響因素復雜，通過有效的干預手段促進BMSCs 的成骨分化有助于增強BMSCs 在骨折愈合中的作用。

近些年，基因治療在干細胞成骨分化、骨折愈合中的應用備受關注，解整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）基因的編碼產物定位于細胞膜，在調控細胞黏附、運動、分化中均起到作用［5－7］。 一項口腔科相關的研究證實在牙周膜干細胞成骨分化過程中ADAM10 的表達逐步降低，通過慢病毒感染的方式進行ADAM10 過表達對牙周膜干細胞的成骨分化具有抑制作用且這一作用與抑制Notch1 信號通路有關［8］，但該基因在BMSCs 成骨分化中的作用及其在骨折愈合中的潛在效應尚不清楚。 因此，本實驗通過穩定敲低ADAM10 表達的細胞實驗及脛骨骨折的動物實驗分析ADAM10 基因對BMSCs 成骨分化及脛骨骨折愈合的影響，同時也分析Notch1 信號通路在ADAM10基因調控BMSCs 成骨分化及脛骨骨折愈合中的作用，旨在深入認識BMSCs 成骨分化的調控機制，發現促進脛骨骨折愈合的新治療靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司［SCXK（滬）2018－0004］，共20 只，8 ～10周齡，體重180～200 g，實驗動物于鄭州澍青醫學高等專科學校動物房飼養［SYXK（豫）2022－0004］，溫度20～22℃，濕度50%～55%，12 h／12 h 光照／黑暗交替，自由飲食攝水。 實驗經鄭州市澍青醫學高等專科學校醫學倫理委員會批準（2021KYLL-Y-019），動物實驗遵循3R 原則。

1.1.2 細胞

SD 大鼠BMSCs（貨號：RASMX-01001）購自廣州賽業生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

陰 性對 照（negative control，NC） shRNA 及ADAM10 shRNA 的pGFP-V-RS 載體、NC shRNA 及ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 載體（北京傲銳東源生物公司）；轉染試劑Lipo2000（美國Invitrogen 公司，批號：11668027）；地塞米松（批號：D1756）、β-甘油磷酸鈉（批號：G6251）、維生素C（批號：A7506）、茜素紅（批 號： A5533）、 Notch1 激動 劑丙戊 酸（Valproic acid，VPA） （批號：P4543） （儲存液用DMSO 配置、濃度1.0 mol／L）（美國Sigma 公司）；堿性磷酸酶（ALP）活力檢測試劑盒（北京索萊寶公司，批號：BC2145）；HE 染色試劑盒（上海碧云天公司，批號：C0105）；ADAM10（批號：ab124695）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）（批號：ab133612）、Runt 相關轉錄因子2 （Runt-related transcription factor 2，Runx2）（批號：ab76956）、I 型膠原（Type I collagen，Col-I）（批號：ab34710）、Notch 受體胞內部分（Notch intracellular domain，NICD）（批號：ab52627）、發狀分裂相關增強子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）（批號：ab108937）的特異性一抗（美國Abcam 公司）。 HERAcell 150i 型細胞培養箱（美國Thermo 公司）；Tanon4800 型凝膠成像系統（上海天能儀器公司）；VISION90 型小動物科研X 光機檢測儀（丹東奧龍射線儀器集團有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞實驗

BMSCs 在完全培養基中貼壁培養，消化傳代后接種在培養皿內進行分組轉染，轉染5 mg／L NC shRNA 的pGFP-V-RS 載體、5 mg／L ADAM10 shRNA的pGFP-V-RS 載體，48 h 后更換為含有1 g／L 嘌呤霉素的篩選培養基，篩選得到穩定轉染的BMSCs。

穩定轉染的BMSCs 分組：為驗證ADAM10 的調控作用，不進行轉染的BMSCs 作為對照組，穩定轉染NC shRNA 的BMSCs 作為sh-NC 組、穩定轉染ADAM10 shRNA 的BMSCs 作為sh-ADAM10 組；為驗證Notch1 在ADAM10 發揮調控作用中的生物學意義，穩定轉染NC shRNA 的BMSCs 加入體積分數0.1%的DMSO 作為sh-NC ＋DMSO 組，穩定轉染ADAM10 shRNA 的BMSCs 加入體積分數0.1%的DMSO 作 為 sh-ADAM10 ＋DMSO 組， 穩 定 轉 染ADAM10 shRNA 的BMSCs 加入終濃度1.0 mmol／L的VPA 作為sh-ADAM10＋VPA 組。

各組BMSCs 按照1×105個／孔加入6 孔培養板，待細胞密度達到約80%后更換為含有0.1 μmol／L 地塞米松、10 mmol／L β-甘油磷酸鈉、50 mg／L 維生素C、10%胎牛血清的成骨誘導培養基，每2 d 更換1 次培養基，連續進行成骨誘導14 d。

1.3.2 動物分組、造模及給藥

SD 大鼠隨機分為sh-NC 組和sh-ADAM10 組，每組各10 只，均參照文獻［9］進行脛骨骨折造模，方法如下：腹腔注射2%戊巴比妥鈉、30 mg／kg 麻醉，在左下肢前外側、脛骨中上1／3 處做縱行切口，顯露脛骨骨干，手術刀來回橫截造成骨折，術中能夠明顯聽到骨頭斷裂的裂紋聲且術后進行脛骨X 線攝片檢查、出現骨折線判斷為造模成功。 用長度17 mm 的克氏針固定骨折的脛骨，完成造模后在骨折局部進行pCMV5.0 載體的注射。 sh-NC 組注射5 mg／kg NC shRNA 的pCMV5.0 載體、sh-ADAM10 組注射5 mg／kg ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 載體，4周后評價骨折愈合情況。

1.3.3 細胞的茜素紅染色

成骨誘導14 d 時，收集細胞并在0.1%茜素紅中染色30 min，在顯微鏡下觀察茜素紅陽性染色的鈣結節，拍照記錄后每孔加入10%氯化十六烷基吡啶500 μL，充分震蕩使鈣結節溶解，將50 μL 液體移入96 孔培養板的培養孔內，在酶標儀上檢測405 nm 的波長值。

1.3.4 細胞ALP 活性的檢測

成骨誘導14 d 時，收集細胞并采用細胞ALP 活性檢測試劑盒進行實驗，裂解細胞后分別檢測ALP活性（以U／L 表示）及蛋白濃度（以mg／L 表示），計算每mg 蛋白對應的ALP 活性。

1.3.5 細胞及組織中蛋白表達的檢測

收集成骨誘導14 d 時的BMSCs 和脛骨骨折處骨組織，加入裂解液后進行細胞裂解或組織勻漿，提取得到蛋白后檢測濃度，將含有30 μg 蛋白樣本用于Western blot 檢測，電泳、電轉PVDF 膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后4℃孵育1 ∶1000 稀釋的ADAM10、OCN、Runx2、Col-I、NICD、Hes1 一抗或1 ∶5000 稀釋的β-actin 一抗過夜。 次日，室溫孵育二抗1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值、以β-actin 為內參，計算ADAM10、OCN、Runx2、Col-I、NICD、Hes1 的表達水平。

1.3.6 骨折愈合的評價

首先采用VISION90 型小動物科研X 光機檢測儀進行X 線檢查，觀察骨折局部的影像學變化；而后收集脛骨骨折處的骨組織，4%多聚甲醛固定后制作組織蠟塊及病理切片，采用HE 染色試劑盒完成染色操作，封片后在顯微鏡下觀察骨折局部的骨痂及骨小梁特征。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對實驗數據進行統計學處理，計量資料以平均數±標準差（±s）表示，組間比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs 成骨誘導后不同時間點ADAM10 表達水平的比較

BMSCs 成骨誘導后不同時間點ADAM10 表達水平的比較均有統計學差異（P＜0.05），隨著成骨誘導時間延長，BMSCs 中ADAM10 的表達水平呈逐步降低趨勢，提示在BMSCs 成骨分化的過程中ADAM10 的表達受到抑制。 見圖1。

注：與誘導0 d 時比較， *P＜0.05；與誘導7 d 時比較， ＆P＜0.05。圖1 BMSCs 成骨誘導后不同時間點ADAM10表達水平的比較Note.Compared with 0 d of induction， *P＜0.05.Compared with 7 days after induction， ＆P＜0.05.Figure 1 Comparison of ADAM10 expression levels at different time points after osteogenesis induction of BMSCs

2.2 不同轉染組BMSCs 中ADAM10 表達水平的比較

對照組與sh-NC 組BMSCs 中ADAM10 表達水平的比較無顯著差異（P＜0.05）；sh-ADAM10 組BMSCs 中ADAM10 表達水平均低于對照組和sh-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明穩定轉染sh-ADAM10 使BMSCs 中ADAM10 表達降低。 見圖2。

注：與對照組比較， *P＜0.05；與sh-NC 組比較， ＆ P＜0.05。圖2 不同轉染組BMSCs 中ADAM10 表達水平的比較Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh0NC group， ＆P＜0.05.Figure 2 Comparison of ADAM10 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.3 抑制ADAM10 表達對BMSCs 成骨分化的影響

sh-ADAM10 組BMSCs 成骨誘導后茜素紅染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均高于對照組和sh-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明敲低ADAM10 表達促進BMSCs 的成骨分化。 見圖3。

注：A：茜素紅染色；B：405 nm 吸光值的比較； C：LP 活性的比較。 與對照組比較， *P＜0.05；與sh-NC 組比較， ＆P＜0.05。圖3 不同轉染組BMSCs 中ADAM10 表達水平的比較Note.A， Alizarin red staining.B， Comparison of absorbance at 405 nm.C， Comparison of ALP activity.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 3 Comparison of ADAM10 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.4 抑制ADAM10 表達對BMSCs 成骨誘導后成骨標志基因表達的影響

sh-ADAM10 組BMSCs 成骨誘導后OCN、Runx2、Col-I 的表達水平均高于對照組和sh-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明敲低ADAM10表達促進BMSCs 中成骨標志基因的表達。 見圖4。

注：與對照組比較， *P＜0.05；與sh-NC 組比較， ＆P＜0.05。圖4 不同轉染組BMSCs 中OCN、Col-I 和Runx2 表達水平的比較Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 4 Comparison of OCN， Col-I and Runx2 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.5 抑制ADAM10 表達對BMSCs 成骨誘導后Notch1 通路的影響

sh-ADAM10 組BMSCs 成骨誘導后NICD、Hes1的表達水平均低于對照組和sh-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明敲低ADAM10 表達抑制BMSCs 中Notch1 信號通路的激活。 見圖5。

注：與對照組比較， *P＜0.05；與sh-NC 組比較， ＆P＜0.05。圖5 不同轉染組BMSCs 中NICD、Hes1 表達水平的比較Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 5 Comparison of NICD， Hes1 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.6 Notch1 通路激動劑VPA 對抑制ADAM10 表達促進BMSCs 成骨分化的影響

sh-ADAM10＋DMSO 組BMSCs 成骨誘導后茜素紅染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均高于sh-NC＋DMSO 組（P＜0.05）；sh-ADAM10 ＋VPA 組BMSCs成骨誘導后茜素紅染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均低于sh-ADAM10＋DMSO 組（P＜0.05），表明激活Notch1 通路使敲低ADAM10 表達促進BMSCs 成骨分化的作用減弱。 見圖6。

注：A：茜素紅染色；B：405 nm 吸光值的比較；C：ALP 活性的比較。 與sh-NC＋DMSO 組比較， *P＜0.05；與sh-ADAM10＋DMSO 組比較， ＆P＜0.05。圖6 Notch1 通路激動劑VPA 對抑制ADAM10 表達促進BMSCs 成骨分化的影響Note.A， Alizarin red staining.B， Comparison of absorbance at 405 nm.C， Comparison of ALP activity.Compared with the sh-NC＋DMSO group， *P＜0.05.Compared with sh-ADAM10＋DMSO group， ＆P＜0.05.Figure 6 Effect of Notch1 pathway agonist VPA on the inhibition of ADAM10 expression promoting osteogenic differentiation of BMSCs

2.7 Notch1 通路激動劑VPA 對抑制ADAM10 表達促進BMSCs 中成骨標志基因表達的影響

sh-ADAM10＋DMSO組BMSCs成骨誘導后OCN、Runx2、Col-I 的表達水平均高于sh-NC＋DMSO 組（P＜0.05）；sh-ADAM10 ＋VPA 組BMSCs 成骨誘導后OCN、Runx2、Col-I 的表達水平均低于sh-ADAM10＋DMSO 組（P＜0.05），表明激活Notch1 通路使敲低ADAM10 表達促進BMSCs 中成骨標志基因表達的作用減弱。 見圖7。

注：與sh-NC＋DMSO 組比較， *P＜0.05；與sh-ADAM10＋DMSO 組比較， ＆P＜0.05。圖7 Notch1 通路激動劑VPA 對抑制ADAM10 表達促進BMSCs 中成骨標志基因表達的影響Note.Compared with the sh-NC＋DMSO group， *P＜0.05.Compared with sh-ADAM10＋DMSO group， ＆P＜0.05.Figure 7 Effect of Notch1 pathway agonist VPA on the inhibition of ADAM10 expression promoting osteogenic marker genes expression of BMSCs

2.8 抑制ADAM10 表達對大鼠脛骨骨折愈合的影響

經X 射線檢查，sh-NC 組脛骨骨折大鼠的骨折線清晰，sh-ADAM10 組脛骨骨折大鼠的骨折線幾乎消失；經HE 染色，sh-NC 組大鼠的骨痂纖維較多、成熟的小梁骨較少，sh-ADAM10 組大鼠的骨痂明顯增多、且形成成熟的小梁骨，表明敲低ADAM10 表達促進脛骨骨折愈合。 見圖8。

注：A：脛骨骨折的X 射線檢查，箭頭所指為骨折線；B：脛骨骨折的HE 染色。圖8 抑制ADAM10 表達對大鼠脛骨骨折愈合的影響Note.A， X-ray examination of tibial fracture.B， HE staining of tibial fracture.Figure 8 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on tibial fracture healing in rats

2.9 抑制ADAM10 表達對大鼠脛骨骨折中成骨標志基因表達的影響

sh-ADAM10 組脛骨骨折大鼠骨折部位中OCN、Runx2、Col-I 的表達水平均高于sh-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），結果表明敲低ADAM10 表達促進脛骨骨折愈合過程中的成骨標志基因表達。見圖9。

注：與sh-NC 組比較， *P＜0.05。圖9 抑制ADAM10 表達對大鼠脛骨骨折中成骨標志基因表達的影響Note.Compared with the sh-NC group， *P＜0.05.Figure 9 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on osteogenic marker genes expression in rat tibia fracture

2.10 抑制ADAM10 表達對大鼠脛骨骨折中Notch1 通路的影響

如圖10所示，sh-ADAM10組脛骨骨折大鼠骨折部位中NICD、Hes1 的表達水平均低于sh-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明敲低ADAM10表達促進脛骨骨折愈合過程中Notch1 信號通路的激活。

注：與sh-NC 組比較， *P＜0.05。圖10 抑制ADAM10 表達對大鼠脛骨骨折中Notch1 通路的影響Note.Compared with the sh-NC group， *P＜0.05.Figure 10 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on Notch1 pathway in rat tibia fracture

3 討論

脛骨骨折多由交通事故、高處墜落等高能量暴力引起，脛骨局部存在軟組織薄弱、穿支血管少的解剖特點，高能量暴力容易引起局部軟組織缺損及血供損害，進行切開復位內固定治療后的不愈合或延遲愈合發生風險較高。 國內葛向榮等［10］和趙國平等［2］的臨床研究分別報道脛骨骨折后延遲愈合的發生率為34.31%和27.16%。 骨折延遲愈合或不愈合不僅影響肢體功能、降低生活質量，還增加二次手術風險、加大經濟負擔，因此需要進行積極防治［11－12］。 本研究通過細胞實驗和動物實驗分析了ADAM10 基因對BMSCs 成骨分化及脛骨骨折愈合的影響。

ADAM10 的主要生物學功能是對各種細胞因子及受體、結構蛋白實現剪切，進而調控不同的生物學過程［5－7］。 本研究對BMSCs 進行成骨誘導分化，在分化過程中ADAM10 的表達水平也呈逐步降低趨勢，與朱永翠等［8］的研究結果一 致。 為了驗證ADAM10 基因在BMSCs 成骨分化中的調控作用，本研究在成骨誘導前先構建了穩定轉染pGFP-V-RS載體的BMSCs，而后進行成骨誘導分化并檢測，結果顯示，敲低ADAM10 表達使BMSCs 成骨誘導分化后的鈣結節數量及ALP 活性均明顯增加。 干細胞的成骨分化過程涉及多種標志基因的變化，Col-I 和OCN 分別是骨基質中主要的膠原成分和非膠原成分，Runx2 是調控成骨分化的關鍵基因［13－14］，本研究在穩定敲低ADAM10 的BMSCs 進行成骨誘導后檢測到Col-I、OCN、Runx2 的表達水平增加，與成骨誘導后鈣結節數量及ALP 活性增加的結果吻合。以上結果表明敲低ADAM10 基因顯著抑制BMSCs的成骨分化。

根據朱永翠等［8］的研究，ADAM10 對牙周膜干細胞中Notch1 通路具有調控作用。 Notch1 通路在成骨分化及骨折愈合中起重要作用，有研究報道抑制Notch1 通路對干細胞的成骨分化具有促進作用，在骨折愈合過程中Notch1 表達下調是骨形成的必備條件［15－16］。 Notch1 是一類膜受體，與配體結合后通過三次酶切反應將胞內結構域NICD 釋放進入胞漿，作用與Hes1 并調控細胞增殖及分化。 ADAM10具有水解細胞膜受體胞內或胞外結構域的功能，多項研究證實ADAM10 能夠水解Notch1 的胞內結構域并產生NICD［17－19］。 本研究在穩定敲低ADAM10的BMSCs 進行成骨誘導后檢測到NICD 及Hes1 的表達均明顯降低，在成骨誘導的過程中持續給予Notch1 激動劑VPA 干預后、穩定敲低ADAM10 促進成骨分化的作用被削弱，表明敲低ADAM10 促進成骨分化的作用與抑制Notch1 通路有關。

在脛骨骨折的愈合過程中，BMSCs 在骨折局部遷移、浸潤并發生成骨分化對新骨形成具有重要意義。 為了更深入認識ADAM10 基因調控BMSCs 成骨分化在脛骨骨折愈合中的生物學意義，本研究建立了脛骨骨折大鼠模型，在骨折局部注射ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 載體以敲低ADAM10，通過觀察骨折愈合情況可知：敲低ADAM10 后加速了脛骨骨折的愈合，骨折部位的骨折線幾乎消失且膠原形成、ALP 活性及OCN、Runx2、Col-I 的表達水平均明顯增加，同時還觀察到Notch1 通路中NICD、Hes1 的表達降低。 以上動物實驗結果與干細胞實驗的結果吻合，表明敲低ADAM10 顯著促進脛骨骨折的愈合。

綜上所述，本研究通過細胞實驗及動物實驗證實敲低ADAM10 促進BMSCs 的成骨分化及脛骨骨折的愈合，這一促進作用與抑制Notch1 通路有關，這為今后脛骨骨折后不愈合及延遲愈合的防治提供了新思路。