低劑量BPA 和DEHP 對成年大鼠前列腺AKR1C3的影響

黃冬妍吳雙雙邵叢叢蘇 欣楊榮富王凱玥周 萍吳建輝*

（1.上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院，上海 200032；2.國家衛(wèi)生健康委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院，上海 200032）

雙酚A（bisphenol A，BPA）和鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（di （2-ethylhexyl） phthalate，DEHP）是兩種較為重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（environmental endocrine disruptors，EDCs），廣泛存在于填充劑原料、高分子材料、化妝品以及增塑劑中，以類激素的形式產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，使體內(nèi)原有的內(nèi)分泌機(jī)能出現(xiàn)紊亂，從而對生物或人體的生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等的功能產(chǎn)生影響［1］。 隨著工業(yè)的發(fā)展，BPA 和DEHP 環(huán)境暴露劑量及在人體內(nèi)的蓄積量逐年上升。 盡管美國食品與藥物管理局（Food and Drug Administration， FDA） 和 美 國 環(huán) 保 署（ U.S.Environmental Protection Agency，EPA）將50 μg／kg視為每日攝入的“安全”劑量［2］，但是BPA 低水平暴露仍是一種潛在的破壞劑，會(huì)對生殖系統(tǒng)如前列腺的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。 研究表明妊娠期口服BPA（10 μg／（kg·d））會(huì)導(dǎo)致雄性胎小鼠背外側(cè)前列腺導(dǎo)管數(shù)量和體積增加；青春期長期攝入BPA（40 μg／（kg·d））促進(jìn)前列腺細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)沙鼠成年前列腺增生［3］。 同樣作為一種常見的EDC，DEHP 的低水平暴露研究相對較少，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在典型的飲食方式下，育齡婦女、青少年和嬰兒DEHP暴露劑量分別為5.7、8.1 和42.1 μg／（kg·d）［4］。歐洲食品安全局規(guī)定DEHP 日耐受攝入劑量為50 μg／（kg·d），而EPA 將20 μg／（kg·d）作為安全參考劑量［5］。 由于BPA 和DEHP 的廣泛應(yīng)用，我們想明確在環(huán)境暴露劑量下兩者對前列腺的影響，為評估EDCs 潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)提供理論基礎(chǔ)。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，給予成年和老年大鼠10～90 μg／kg 的BPA 能引起或促進(jìn)前列腺增生，0.01～1 nmol BPA 可以促進(jìn)大鼠原代前列腺上皮細(xì)胞增殖，30～270 μg／kg DEHP 對老年大鼠前列腺有促進(jìn)增生作用［6－8］。 BPA 和DEHP 促進(jìn)前列腺增生的作用主要通過模擬，增強(qiáng)或抑制內(nèi)源性雌激素活性，干擾雄激素系統(tǒng)，影響神經(jīng)－內(nèi)分泌作用以及誘導(dǎo)激素調(diào)控下細(xì)胞因子和通路的改變來實(shí)現(xiàn)［6－8］，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)成年大鼠前列腺增生中前列腺素D2合成酶基因（prostaglandin D2synthase gene，PTGDS）的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)［6］，提示前列腺素合成酶基因調(diào)控可能與前列腺疾病的進(jìn)展相關(guān)。

前列腺素合成酶（prostaglandin synthase，PGS）是與膜結(jié)合的多酶系統(tǒng)，在體內(nèi)的花生四烯酸代謝途中催化底物生成各種具有生理活性的前列腺素［9］，主要包括環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2）、前列腺素E 合成酶（prostaglandin E synthase，PGES）、膜結(jié)合型前列腺素E2合成酶1（microsomal prostaglandin E2synthase-1，mPGES-1）、Lipocalin 型前列腺素D 合成酶（lipocalin-type prostaglandin D synthase， L-PGDS ） 和 前 列 腺 素 F 合 成 酶（prostaglandin F synthase，PGFS）等。 在PGS 家族中，多種前列腺素合成酶都具有激素反應(yīng)性，如PGFS 是催化前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2）和前列腺素D（prostaglandin D，PGD）轉(zhuǎn)化為前列腺素F（prostaglandin F，PGF）的末端酶，PGF 在雌性動(dòng)物中的表達(dá)多與妊娠、動(dòng)情周期、分娩相關(guān)，雌激素水平升高可能促進(jìn)PGFS 的表達(dá)和PGF 增多［10］。醛酮還原酶1C3（aldo-keto reductase family 1 member C3，AKR1C3）是PGFS 的一種，可催化5α－二氫睪酮（強(qiáng)雄激素）轉(zhuǎn)化為3α－雄甾烷二醇（弱雄激素），β4－雄烯－3，17 二酮（弱雄激素）轉(zhuǎn)化為睪酮（強(qiáng)雄激素），將雌酮（弱雌激素）轉(zhuǎn)化為17β 雌二醇（強(qiáng)雌激素）等［11］。 AKR1C3 參與睪酮和雌激素代謝，可以參與到激素敏感性組織的生長發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展中，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、精子發(fā)生異常等［12］。 有研究表明，AKR1C3 位于雄激素合成通路終末端，是前列腺癌（prostate cancer，PCa）細(xì)胞合成睪酮和雙氫睪酮的關(guān)鍵酶，在一些PCa 細(xì)胞中AKR1C3 可通過激活雄激素受體（ androgen receptors，AR）信號通路放大外源低水平雄激素信號并增加自身雄激素合成［13］。

我們還發(fā)現(xiàn)低劑量的BPA 可以上調(diào)COX-2 和L-PGDS 的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖和凋亡，從而誘導(dǎo)前列腺增生［14］。 BPA 和DEHP 作為典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是否還能影響其他前列腺素合成酶的表達(dá)？ 目前還鮮少有人研究。 因此，本文將初步探討環(huán)境暴露劑量下BPA 和DEHP 對前列腺種AKR1C3 的影響，研究結(jié)果將為前列腺疾病的發(fā)生機(jī)制提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

56 只成年雄性SD 大鼠（SPF 級），6～7 周齡，接收時(shí)體重140 ～160 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（浙）2019－0001］。 在上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院［SYXK（滬）2019－0012］屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)至3 月齡，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，光照和黑暗各12 h；用大小鼠高壓飼料喂養(yǎng)，自由飲水。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批件（2019－28），嚴(yán)格按照3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

BPA（貨號：239658，含量≥99%）、DEHP（貨號：D201154，含量≥99.5%）均購于Sigma-Aldrich公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（貨號：20140520）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；供試品使用前以0.5%的CMC-Na 均勻分散。 大鼠PGFS ELISA Kit（MBS9310151-96） 購 于 美 國 MyBiosource 公 司；Rabbit Anti-AKR1C3 Antibody （ ab196673） 購 于Abcam 公司；即用型免疫組化UltraSensitive TM SP試劑盒（鼠／兔）（貨號：KIT9720）、粉劑型抗原修復(fù)液（貨號：MVS-0066）、DAB 顯色試劑（20×）（貨號：DAB-0031）、蘇木素體細(xì)胞染色液（貨號 CTS-1090）、PBS 磷酸鹽緩沖液（粉型）（貨號：PBS-0060）均購自福州邁新生物科技有限公司。

低溫 水 平 式 離 心 機(jī)（ Allegra-12R， 美 國Beckman）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（SI-600R，韓國杰奧特）； 電 腦 洗 板 機(jī)（DNX-9620， 北 京 普 朗 新）；Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀（1510-04177C，Thermo Fisher Scientific）；Leica 石蠟切片機(jī)（RM2126，德國徠卡）；Leica 全自動(dòng)染色機(jī)（Leica ST5010 德國徠卡）；光學(xué)顯微鏡（DM3000，德國徠卡）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組和給藥

56 只3 月齡雄性SD 大鼠按照體重隨機(jī)分為7組，依次為對照組、BPA 10 μg／kg、30 μg／kg、90 μg／kg 劑量組和DEHP 30 μg／kg、90 μg／kg 及270 μg／kg 劑量組，每組8 只動(dòng)物，分別灌胃（intragastric administration，i.g.）給予10 mL／kg 溶媒，相應(yīng)劑量的BPA 和DEHP，連續(xù)4 周。 動(dòng)物體重每周稱量1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，于第4 周末次給藥24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，處死動(dòng)物。

1.3.2 前列腺取材

動(dòng)物處死后，剖取前列腺組織，并將其分為腹側(cè)葉和背側(cè)葉，將各葉前列腺組織分為三部分，一部分用10%的福爾馬林溶液固定，用于病理分析；另外兩部分均保存于液氮中，用于進(jìn)一步的分析。

1.3.3 ELISA 法檢測AKR1C3 水平

腹主動(dòng)脈采血，靜置兩小時(shí)后離心（3590 r／min，15 min），分離出血清。 前列腺組織稱重后剪碎按照1 ∶10（w ∶v）比例加入生理鹽水，用手動(dòng)勻漿器在冰上超聲勻漿，重復(fù)3 次，充分勻漿后離心（3590 r／min，15 min），收集勻漿上清液。 ELISA 法檢測血清和前列腺中AKR1C3 水平。 將所有的試劑平衡至室溫；蒸餾水稀釋濃縮洗滌液，用去離子水重配標(biāo)準(zhǔn)品至相應(yīng)的濃度，室溫放置10 min 備用。 測定步驟如下：

加樣：加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、和樣品稀釋液（空白孔）至相應(yīng)的孔中。

孵育：每孔加入結(jié)合劑，混合均勻，封板膜封板后37℃孵育1 h。

洗滌：撕掉封板膜后棄去液體，設(shè)置洗板機(jī)注水量為400 μL，浸潤10 s，震蕩5 s，洗板5 次，洗滌后用吸水紙拍干。

顯色：每孔依次加入顯色試劑，封板膜封板后37℃避光孵育10 min。

終止：每孔加入50 μL 的終止液，混合均勻，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色）。

測定：15 min 以內(nèi)用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定（450 nm波長）。

計(jì)算：擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線并生成曲線方程，帶入樣本OD 值計(jì)算樣本濃度。

1.3.4 免疫組化法檢測AKR1C3 表達(dá)情況

取前列腺腹側(cè)葉和背側(cè)葉組織，按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行如下操作：脫蠟水化：二甲苯（5 min／次，2 次）→無水乙醇（5 min／次，2 次）→95%乙醇（5 min／次，2 次）→75%乙醇（5 min／次，2 次）去離子水（3 min／次，3 次）；抗原修復(fù)：切片浸沒于0.01 mol 原修復(fù)液中，微波修復(fù)20 min，室溫冷卻，取出后PBS 浸洗2 min／次，3 次；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷：每張切片滴加一滴試劑A，室溫孵育10 min，PBS 浸洗3 min／次，3 次；血清封閉：每張切片滴加一滴試劑B，室溫孵育10 min；加一抗：每張切片加50 μL 一抗（陰性對照用PBS 替代），4℃孵育過夜，PBS 浸洗3 min／次，3 次；加二抗：每張切片滴加一滴試劑C，室溫孵育10 min；PBS 浸洗3 min／次，3次，每張切片滴加一滴試劑C，室溫孵育10 min；PBS浸洗3 min／次，3 次；顯色：配制DAB 溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）每張切片加100 μL 顯色液，顯微鏡下觀察顯示棕黃色顆粒即終止顯色；復(fù)染：蘇木素復(fù)染4 min，水化1 min，鹽酸分化4 s，流水洗11 min；干燥透明：75%乙醇（5 min／次，2 次）→95%乙醇（5 min／次，2次）→無水乙醇（5 min／次，2 次）→二甲苯（5 min／次，2 次）；封片：中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

每組選取6 個(gè)動(dòng)物組織切片，隨機(jī)觀察每張切片的10 個(gè)視野，切片出現(xiàn)的棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，用Image-Pro Plus 6.0 測定切片圖像的平均光密度，進(jìn)行蛋白表達(dá)的半定量統(tǒng)計(jì)，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有顯著性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AKR1C3 水平變化

ELISA 檢測結(jié)果顯示（圖1），給予BPA 后，與對照組相比，各劑量組血清AKR1C3 水平無顯著性變化；腹側(cè)前列腺AKR1C3 的水平無明顯變化，但90 μg／kg 劑 量 組 略 高 于 對 照 組；背 側(cè) 前 列 腺AKR1C3 的水平升高，10 μg／kg 劑量組有顯著性差異（P＜0.01）。 給予DEHP 后，隨著劑量增加血清AKR1C3 的水平上升，270 μg／kg 劑量組顯著性高于對照組（P＜0.001）；腹側(cè)前列腺AKR1C3 水平均顯著性高于對照組（P＜0.05，P＜0.01）；背側(cè)前列腺中，30 μg／kg 和90 μg／kg 劑量組AKR1C3 的水平高于對照組。 （表1）

表1 BPA 和DEHP 對SD 大鼠AKR1C3 水平的影響（±s，n＝8）Table 1 Effects of BPA and DEHP on AKR1C3 level in SD rats

表1 BPA 和DEHP 對SD 大鼠AKR1C3 水平的影響（±s，n＝8）Table 1 Effects of BPA and DEHP on AKR1C3 level in SD rats

注：與對照組相比， *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001。Note.Compared with the control group， *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001.

組別Groups 劑量（μg／kg）Doses血清（ng／mL）Serum腹側(cè)前列腺葉（ng／g）Ventral prostatic lobe背側(cè)前列腺葉（ng／g）Dorsal prostatic lobe對照組Control group 0 1.18±0.09 18.08±3.55 11.60±3.78 BPA 10 0.96±0.13 17.61±1.24 18.10±4.57*30 0.98±0.11 17.84±2.22 12.30±0.73 90 1.13±0.08 19.84±1.06 16.52±2.43 DEHP 30 1.14±0.17 21.66±1.36* 16.62±6.79 90 1.31±0.18 21.25±0.51* 14.39±3.75 270 2.76±0.38*** 22.03±1.21** 11.67±0.82

注：A：血清；B：腹側(cè)前列腺；C：背側(cè)前列腺。 與對照組相比， *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001。圖1 BPA 和DEHP 對SD 大鼠血和前列腺組織中AKR1C3 水平的影響Note.A， Serum.B， Ventral prostatic lobe.C， Dorsal prostatic lobe.Compared with the control group， *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001.Figure 1 Effects of BPA and DEHP on the level of AKR1C3 in serum and prostate of SD rats

2.2 前列腺組織中AKR1C3 的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，給予BPA 后，與對照組相比，腹側(cè)前列腺中，30 μg／kg 和90 μg／kg 劑量組AKR1C3 表達(dá)升高，且90 μg／kg 劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），背側(cè)前列腺中，各劑量組AKR1C3 表達(dá)均升高，10 μg／kg 劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；給予DEHP 后，與對照組相比，腹側(cè)前列腺中，各劑量組AKR1C3 表達(dá)均升高，270 μg／kg 劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），背側(cè)前列腺中，各劑量組AKR1C3 表達(dá)也均升高，30 μg／kg 和90 μg／kg 劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.05）（見表2，圖2～圖4）。

表2 BPA 和DEHP 對SD 大鼠前列腺AKR1C3表達(dá)的影響（±s，n＝8）Table 2 Effects of BPA and DEHP on the expression of AKR1C3 in prostateOf SD rats

表2 BPA 和DEHP 對SD 大鼠前列腺AKR1C3表達(dá)的影響（±s，n＝8）Table 2 Effects of BPA and DEHP on the expression of AKR1C3 in prostateOf SD rats

注：與對照組相比， *P＜0.05， ***P＜0.001。Note.Compared with the control group， *P＜0.05， ***P＜0.001.

組別Groups劑量（μg／kg）Doses腹側(cè)前列腺Ventral prostatic lobe背側(cè)前列腺Dorsal prostatic lobe對照組Control group 0 0.181±0.015 0.128±0.029 BPA 10 0.177±0.009 0.206±0.020***30 0.197±0.010 0.151±0.011 90 0.236±0.016* 0.157±0.021 DEHP 30 0.211±0.021 0.225±0.010***90 0.201±0.020 0.171±0.019*270 0.247±0.047* 0.154±0.022

圖2 BPA 和DEHP 對SD 大鼠腹側(cè)前列腺AKR1C3 表達(dá)的影響Figure 2 Effects of BPA and DEHP on the expression of AKR1C3 in ventral prostate of SD rats

圖3 BPA 和DEHP 對SD 大鼠背側(cè)前列腺AKR1C3 表達(dá)的影響Figure 3 Effects of BPA and DEHP on the expression of AKR1C3 in dorsal prostate of SD rats

注：A：腹側(cè)前列腺；B：背側(cè)前列腺。 與對照組相比， *P＜0.05， ***P＜0.001。圖4 BPA 和DEHP 對SD 大鼠前列腺AKR1C3 表達(dá)的影響Note.A， Ventral prostatic lobe.B， Dorsal prostatic lobe.Compared with the control group， *P＜0.05， ***P＜0.001.Figure 4 Effects of BPA and DEHP on the expression of AKR1C3 in prostate of SD rats

3 討論

BPA 和DEHP 應(yīng)用廣泛，人們可以通過攝取、吸入、皮膚接觸等多種途徑暴露其中。 本次研究發(fā)現(xiàn)，給予10～90 μg／kg 的BPA 和30 ～270 μg／kg 的DEHP 后，AKR1C3 水平和蛋白表達(dá)均升高，腹側(cè)前列腺葉中高劑量組表現(xiàn)比較明顯，而背側(cè)前列腺葉中低劑量組表現(xiàn)更為明顯，提示背側(cè)前列腺葉對BPA 和DEHP 更敏感。 曾有報(bào)道稱在成纖維細(xì)胞生長因子－2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，背側(cè)前列腺上皮增生比腹側(cè)葉明顯，小鼠背側(cè)前列腺可能與人前列腺周圍帶同源，而前列腺增生和前列腺癌幾乎都源于移行帶和周圍帶［15］。 有研究發(fā)現(xiàn)雌激素通過細(xì)胞核內(nèi)受體途徑促進(jìn)奶牛輸卵管平滑肌組織中PGFS 的表達(dá)，而植物雌激素及其代謝物可以刺激PGF2α 的分泌，明顯增加前列腺素FL2（prostaglandin FL2，PGFL2）基因的表達(dá)，從而促進(jìn)生殖細(xì)胞的活力和增殖［16－17］，BPA 和DEHP 作為2 種植物雌激素，與雌激素作用類似，可能通過同樣的途徑對AKR1C3 的表達(dá)產(chǎn)生影響。

AKR1C3 是PGFS 的一種，可催化強(qiáng)弱雄激素之間的轉(zhuǎn)化以及弱雌激素轉(zhuǎn)化為強(qiáng)雌激素，這種調(diào)節(jié)靶組織中雌雄激素局部濃度的作用使其成為多種激素依賴性病變的研究靶點(diǎn)。 AKR1C3 可以激活A(yù)R 信號誘導(dǎo)雄激素合成，不僅調(diào)節(jié)雄激素的生成，還可以作為AR 的共激活因子以濃度依賴性方式激活A(yù)R。 AKR1C3 在前列腺素化合物合成中也有重要作用，分別催化PGH2 和PGD2 生成前列腺素PGF2α、PGF9α 和11β-PGF2，尤其對PGD2 的催化活性最高［18］。 前列腺作為雄性生殖系統(tǒng)中重要的附屬性腺器官，其生長發(fā)育與雌雄激素調(diào)節(jié)密切相關(guān)。 在前列腺癌中，AKR1C3 過表達(dá)，能調(diào)節(jié)類固醇類激素，與前列腺腺素受體結(jié)合，激活依賴于生長因子的MAP 激酶途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，還能促進(jìn)腫瘤的侵襲性［10］。 此外，PGD2 和NF-κB 信號通路相關(guān)，AKR1C3 介導(dǎo)的PGD2 缺失會(huì)抑制NF-κB 通路，AKR1C3 還可以直接與NF-κB 和雌激素受體α（estrogen receptor-α，ERα）的DNA 結(jié)構(gòu)域殘基反應(yīng)，使NF-κB 和ERα 依賴性基因轉(zhuǎn)錄增加，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［11］。

綜上所述，低劑量BPA 和DEHP 可以促進(jìn)成年SD 大鼠前列腺AKR1C3 的表達(dá)，我們之前有關(guān)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物促進(jìn)前列腺增生的研究，發(fā)現(xiàn)AR 信號通路和NF-κB 信號通路在BPH 的發(fā)展中均發(fā)揮重要作用［19－20］，提示AKR1C3 的過表達(dá)可能是BPA和DEHP 引起前列腺增生的作用機(jī)制之一。 但是，前列腺素合成酶在前列腺細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制以及與雌雄激素受體之間的調(diào)控關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。