骨髓骨片法體外培養大鼠骨髓間充質干細胞和PKH26 標記

陳 爽謝燕燕徐菊菊閆振宇*

（1.華北理工大學，河北 唐山 063000；2.華北理工大學附屬醫院，河北 唐山 063000）

骨再生是各種類型的骨創傷研究的難點問題，因為外傷、車禍等外力難以抵抗的因素造成骨損傷、骨缺損，手術治療是臨床唯一有效的徹底治愈手段。 但是，由于身體不能耐受手術、置換材料發生排斥反應、手術費用昂貴等因素使其在臨床應用上受到一定限制，部分患者常因無法行走而產生心理抑郁。 有研究證實，向牽張成骨模型注射自體骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以對礦化區形成骨再生［1］，并且能夠分化為成骨細胞，再通過旁分泌發揮作用，此細胞易分離、擴增、免疫原性低，間充質干細胞提供了骨再生的新方向之一［2］。 BMSCs 屬于修復機體某些特定組織的一類干細胞，是一種能夠自我復制和分化為多種細胞類型的祖細胞。 另外，多項試驗的研究結果證實了BMSCs 與生物材料具有很好的相容性，形成復合支架促進骨缺損修復、骨組織再生的優勢［3－4］。 近年來，BMSCs 已經成為理想的骨組織工程種子細胞。 有實驗研究表明，骨髓的收集技術會影響BMSCs 的異質性，最后影響軟骨細胞分化，而對成骨或成肪潛力方面無明顯影響［5］。 本實驗中，研究者通過5 d 大鼠乳鼠骨髓骨片法對BMSCs 進行分離培養，并作出鑒定。 然后應用PKH26 程序性標記，觀察對細胞形態、增殖、誘導分化的影響，為BMSCs 體內移植到軟骨的進一步研究提供了實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠5 d 乳鼠和3 ～4 周SD 雄性大鼠分別2 只，前者體重11～13 g，后者體重80 ～90 g，實驗動物均購買于北京華阜康生物科技股份動物公司［SCXK（京）2019－0008］。 動物均飼養在華北理工大學醫學實驗動物中心SPF 級屏障實驗室環境內［SYXK（冀）2020－007］，飼養條件：室溫18～26℃，相對濕度40%～70%。 實驗動物福利倫理審查獲得華北理工大學倫理委員會批準（2022-SY-012），所有實驗動物在實驗過程中均遵守3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM 培養基、0.25% EDTA 胰酶、雙抗（青鏈霉素）均購買于Hyclone 公司，貨號SH30265.01、SH30042.01、SV30010；胎牛血清購買于Gibco 公司，貨號10099-141；PKH26 試劑盒購買于貝博生物科技有限公司，貨號BB-441125；CCK-8 試劑盒購買于北京聚合美生物科技有限公司，貨號MF128-01；油紅O 染色試劑盒、茜素紅S 染色液（0.2%）購買于北京索萊寶科技有限公司，貨號為G1262、G1450；Anti Rat FITC-CD29、Anti Rat FITC-CD90、Anti Rat FITC-CD45 均購買于美國BD 公司。 細胞培養箱購買于美國Termo 公司；流式細胞儀購買于美國Becton Dickinson 公司；熒光倒置相差電子顯微鏡購買于日本Nikon 公司；酶標儀購買于美國Biotek 公司；生物安全柜購買于美國Farma 公司，型號為HR60-IIA2；微量電子天平購買于德國Satorius 公司，型號為TE601-L。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠BMSCs 提取與培養

采用大鼠5 d 乳鼠骨髓骨片法分離培養大鼠BMSCs，具體方法為：取SD 雄性大鼠5 d 乳鼠2 只，頸椎脫臼法處死后，用無菌鑷子、眼科剪輕輕將其后肢皮膚剝離掉，充分暴露雙后肢，分離雙側完整的后肢，去除附著的肌肉和筋膜，用含有1%雙抗的PBS 清洗2 次，并用眼科剪剪成體積小于3 mm3的小碎塊轉移至含10%血清的α-MEM 培養基中，混勻后接種在細胞培養瓶中，放置在37℃的5% CO2細胞培養箱中。 接種48 h 后，可觀察到骨片周圍爬出的是細長的梭形細胞，繼續培養至細胞密度達80%左右，可進行1 ∶2 傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。

傳統大鼠BMSCs 的分離培養方法是采用3 ～4周SD 雄性大鼠2 只，使用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，麻醉劑量2 mL／kg，然后用75%酒精浸泡10 min，傳遞至超凈臺內。 取仰臥位，充分暴露膝關節，將后肢皮膚剪開，小心分離股骨脛骨以及肌肉筋膜等，用無菌PBS 浸泡后，使用1 mL 注射器沖洗骨髓腔，直至無紅色后，收集全部液體，離心，轉移到含10%血清的α-MEM 培養基中，混勻后接種在細胞培養瓶中，放置在37℃的5% CO2細胞培養箱中。 48 h后首次換液，繼續培養至細胞密度達80%左右，可進行1 ∶2 傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.3.2 大鼠BMSCs 鑒定

取第3 代BMSCs，對其進行消化、離心、重懸后得到密度為1×106／mL 的單細胞懸液，分別加入抗大鼠單克隆抗體CD29、CD45、CD90，在4℃下進行30 min 避光孵育，最后加入PBS 重懸，上機檢測，重復檢測3 次。

1.3.3 PKH26 標記大鼠BMSCs

應用PKH26 對第3 代細胞進行染色，配制PKH26 染色工作液：用無血清α-MEM 培養基將PKH26 母液稀釋250 倍后備用。 用100 μL 染色工作液將消化完成的細胞沉淀重懸，直至細胞濃度為107／mL，吹打混勻后加到用錫紙包裹的EP 管中，放入37℃的培養箱進行10 min 的孵育，4℃冰箱中孵育25 min，800 r／min 離心5 min，棄上清液，收集細胞，用PBS 清洗2 次細胞上未結合的PKH26 染色液，加入4 mL 完全培養基重懸細胞，充分吹打混勻，接種在細胞培養瓶中，注意避光，在培養箱內繼續培養，傳代擴增，隨后可以直接在倒置熒光電子顯微鏡下觀察到細胞標記的效果以及熒光的強弱。

1.3.4 CCK-8 法檢測標記與未標記細胞增殖活力

取第3 代被PKH26 標記（實驗）組和未被標記BMSCs（對照）組，制備成單細胞懸液，操作依據CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖能力，具體步驟：分別將實驗組和對照組的細胞濃度調整為2×103／L，每孔100 μL，接種到96 孔培養板，設5 個復孔，在相同條件下培養，每24 h 分別取5 個實驗組和對照組孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養箱中孵育3 h，在酶標儀450 nm 參數下讀取OD 值，連續檢測10 d，以培養時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將PKH26 標記與未標記大鼠BMSCs 的生長曲線繪制出來。

1.3.5 PKH26 標記與未標記細胞成骨成脂誘導及鑒定

（1）細胞成骨誘導及鑒定：成骨誘導液配方為向含10%血清的α-MEM 培養基中加入10 mmol／L β-甘油磷酸鈉、0.05 mmol／L Vc 和100 mmol／L 地塞米松。 取第3 代細胞調整密度為5×105／孔后，在6孔板中接種；當細胞達到70%的融合度時，再替換成骨誘導液，培養至第21 天用茜素紅染色。

（2）細胞成脂誘導及鑒定：成脂誘導液配方為向含10%血清的α-MEM 培養基中加入10 μmol／L胰島素、1 μmol／L 地塞米松、0.5 mmol／L 3－異丁基－卜甲基黃嘌呤和200 μmol／L 吲哚美辛。 取第3 代細胞調整密度為5×105／孔后接種于6 孔板培養；當細胞達到70%融合度時，再替換成脂誘導液，培養至第14 天用油紅O 染色。

1.4 統計學方法

所有實驗數據采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析，用GraphPad Prism 8 軟件進行繪制統計圖。 計量資料表示為平均數±標準差（±s），多組數據間差異比較采用單因素方差分析，兩組數據之間差異比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞的形態觀察

將骨髓骨片接種于培養瓶，經過大鼠BMSCs 原代36 h 的培養，可見少量從骨片周圍爬出，貼壁生長，有大量懸浮的細胞；培養到72 h，第一次半定量換液，懸浮細胞降低，貼壁細胞逐漸增加，大量細胞爬出，它是細長的梭形、三角形、紡錘形；繼續培養到96 h 以后細胞密集生長，出現大片融合現象，呈漩渦狀，可進行1 ∶2 傳代培養。 傳代到第3 代細胞均是呈長梭形，形態一致，具有較強的折光性，融合密度較高時可呈漩渦狀、魚群狀（圖1）。

圖1 原代BMSCs 細胞形態Figure 1 Morphology of primary BMSCs

傳統方法培養的BMSCs 在36 h 僅觀察到少量細胞貼壁，培養到48 h 進行首次換液，觀察到細胞貼壁數量增加，繼續培養到第72 h，觀察到細胞尚未形成群落，排列分散，呈細長梭形；繼續培養到96 h，細胞密度可達50%以上，但仍需繼續培養，尚無法傳代（圖1）。

2.2 流式細胞鑒定

如圖2 所示，經流式細胞儀對表面標志物進行檢測，第3 代大鼠BMSCs 陰性對照為（0.55 ±0.73）%，高表達CD29、CD90，表達量分別為（91.18±1.29）%、（95.04±0.11）%，而低表達CD45，僅有（1.74±0.36）%，差異顯著（P＜0.001），證明分離培養的是大鼠BMSC（表1）。

表1 第3 代大鼠BMSCs 表面抗原表達Table 1 Expression of BMSCs surface antigens in the 3rd generation rats

圖2 流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達Figure 2 Detection of cell surface antigen expression by flow cytometry

2.3 PKH26 標記結果

第3 代細胞經PKH26 染色24 h 后，在熒光顯微鏡下觀察呈紅色，熒光在細胞膜上分布均勻一致，標記率為98%，染色前后BMSCs 細胞形態沒有變化（圖3）。

注：PKH26 標記BMSCS 24 h 后。圖3 PKH26 標記結果Note.24th hour of PKH26 marking BMSCS.Figure 3 PKH26 Mark results

2.4 CCK-8 法測定細胞生長曲線

PKH26 標記組與未標記組大鼠BMSCs 第2 天緩慢生長，第3 天加快生長，到第7 天達到生長增殖高峰期，第8 天至第10 天生長進入平臺期，大體生長曲線表現為倒“S”形。 兩組細胞在460 nm 處的OD 值無顯著差異（P＞0.05），說明PKH26 標記BMSCs 對增殖無顯著影響（圖4）。

圖4 PKH26 標記組與未標記組生長曲線的比較Figure 4 Comparison of growth curve between PKH26 labeled group and unlabeled group

2.5 成骨成脂誘導及染色結果

成骨誘導21 d 后觀察到大量細胞呈絮狀，結節狀生長，茜素紅染色呈紅色結節，這種結節就是沉積下來的鈣鹽；成脂誘導14 d 后觀察到大量細胞內含有空泡狀透亮圈，具有強折光性，油紅O 染色偏紅，是脂滴的形成（圖5）。

注：A：BMSCs 成骨誘導21 d 后茜素紅染色；B：BMSCs 成脂誘導14 d 后油紅O 染色。圖5 BMSCs 成骨茜素紅染色和成脂油紅O 染色Note.A， Alizarin red staining 21 days after osteogenesis of BMSCs.B， Oil red O staining after 14 days of lipogenic induction of BMSCs.Figure 5 BMSCs Alizarin red staining and fatty oil red O staining

3 討論

BMSCs 具有免疫調節、抗炎、抗纖維化等作用，在炎癥環境下，關節腔內注射BMSCs 可能會增加骨異常增殖和異位鈣化的風險［6］。 值得肯定的是，BMSCs 可以代替軟骨細胞進行多次擴增，對最終形成的組織幾乎沒有影響，這使它們成為組織工程中移植細胞來源的主要細胞［7］。 傳統的培養方法如膠原酶消法、貼壁法和差速離心法等可培養BMSCs［8－10］，但短期內大量提取細胞具有一定困難，因此，尋找一種快速高效且穩定的分離純化途徑顯得尤為重要。 本實驗分離培養大鼠BMSCs 采用大鼠5 d 乳鼠骨髓骨片法，傳代至第3 代，經流式細胞學鑒定高表達CD29、CD44、CD90，低表達CD45，并向成骨、成脂方向誘導，證明該方法可獲得純度較高的大鼠BMSCs。

近年來發現，BMSCs 已成為細胞移植、組織工程、基因治療等領域的研究熱點。 有實驗結果證實BMSCs 移植作為治療大鼠肺纖維化模型具有前景性的治療策略，能明顯緩解肺泡炎癥及肺纖維化［11］。 同時，腦動脈栓塞大鼠模型進行BMSCs 移植的實驗結果表明，BMSCs 可增加趨化因子和聚唾液酸化酶的表達，增加腦缺血條件下內源性神經元祖細胞的遷移，說明該機制可能有助于改善腦缺血［12］。 另外，間充質干細胞對關節炎的修復作用機制已逐漸變得成熟，有研究表明BMSCs 可促進軟骨修復［13－14］。 以上這些治療作用的關鍵在于移植過程中對細胞進行標記來觀察其分化、存活及遷移。常用的標記細胞方法包括DAPI 標記、BrdU 標記、Dil 標記等，不過，這些熒光染料都有局限性，DAPI標記是一種標熒光染料，標記細胞核，當標記的細胞死亡后會釋放出DAPI，不需要標記的細胞也會被標記出來，從而引起假陽性，且容易淬滅，不適合用于長期標記［15］。 BrdU 標記是通過免疫組化的方式進行間接觀察，操作不方便，并且標記的細胞死亡后會釋放出BrdU，與DAPI 類似，同樣會造成較高假陽性率［16］。 Dil 標記細胞3 d 后會出現嚴重的細胞毒性反應，35 d 后能被檢測到的標記細胞不足1／2，在體外細胞擴增過程中染色的穩定性低［17］。 因此，選擇一種合適的染料，對大鼠BMSCs 進行標記、示蹤尤為重要。

熒光染料PKH26 是一種新型染料，用于標記活細胞可以發出強烈穩定的紅色熒光。 被標記的細胞與未被標記的細胞相比，形態良好，沒有明顯的區別，標記率為98%，這種方法能較好地檢測出體外細胞誘導分化的情況，或將標記的細胞注射到動物體內，便于觀察活體內移植細胞的遷移情況，從而達到示蹤細胞的目的。 由于PKH26 染色方法簡便、毒性小，不用放射性同位素，安全系數高。 因此，PKH26 是大鼠BMSCs 的理想標記方式，為大鼠BMSCs 在體內遷移分化實驗的后續研究打下了堅實基礎。