日本結縷草(Zoysia japonica)酵母雜交cDNA文庫的構建及分析

李艷茹, 周麗瑩, 董 笛, 劉亞玲, 李舒文, 王夢迪, 晁躍輝*

(1.北京林業大學草業與草原學院, 北京 100083; 2. 北京理工大學生命學院, 北京 100081; 3. 內蒙古草業技術創新中心有限公司, 內蒙古 呼和浩特 010010)

近年來隨著功能基因組學研究的深入推進,分子生物學領域蛋白質相互作用的相關研究成為一個備受關注熱點問題[1]。研究蛋白質之間的相互作用是探究基因功能的重要方面,通過該研究可以深入分析基因編碼產物的作用機制和調控網絡。酵母雙雜交技術是一種分子生物學技術,主要應用于蛋白質相互作用研究[2]。該技術基于酵母菌細胞中的轉錄因子的結構和功能,通過激活報告基因的表達來進行目的蛋白的篩選[3]。同時,酵母雜交技術也可以在一定程度上反映細胞內部的真實情況[4]。構建高容量的cDNA酵母文庫是利用酵母雙雜交技術篩選目的基因以及研究蛋白互作關系的基礎,也是揭示蛋白功能及其作用基礎的前提,所以構建高質量cDNA酵母文庫具有重要意義[5-6]。近年來,酵母雜交技術已廣泛應用于蛋白質互作篩選,并在新基因挖掘及基因調控相關分子機制探究方面發揮了重要作用[7]。

日本結縷草(Zoysiajaponica)適應性廣,抗逆性強,地下根系發達,密度高,覆蓋面廣,是一種優良的禾本科草坪草品種[8-9]。日本結縷草具有極強的逆境適應能力,不僅適應潮濕的沿海地區,還能適應內陸的干旱極端氣候[10]。這些優良特性使得日本結縷草在城市綠化、運動場建設以及水土保持等方面有重要的應用價值[11-12]。高容量的日本結縷草酵母雜交cDNA文庫的構建,為更深層次的探索日本結縷草相關基因提供便利。本研究挑選了來源于不同組織的日本結縷草,并進行不同的脅迫處理或激素誘導,再經過SMART技術進行了高容量的日本結縷草酵母雜交cDNA文庫的構建,該文庫能夠用作篩選試驗,可作為基礎進一步進行蛋白與DNA互作或蛋白質互作等基礎生物學研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所使用的酵母文庫構建試劑盒購自Invitrogen(美國),包括CloneMinerTMII cDNA文庫構建試劑盒、FastTrack MAG mRNA分離試劑盒、PureLinktm快速凝膠提取和PCR純化組合試劑,以及質粒DNA純化試劑盒。此外,于日本TaKaRa公司購買了MatchmakerTM酵母篩庫試劑盒、實驗菌株大腸桿菌DH10B菌株和Y187菌株,以及DNA連接酶、DNA聚合酶和T4 DNA連接酶。實驗藥物乙醇、瓊脂、異戊醇、LB培養基購買自美國Sigma公司。

1.2 日本結縷草總RNA的提取及mRNA分離純化

選取結縷草種子、生長30天的日本結縷草的根莖葉植物組織進行取樣。首先,取0.1 g樣品,將取出的樣品置于液氮中并進行充分研磨直至樣品變成粉末狀。用Trizol法進行總RNA的提取,之后對提取的mRNA進行分離和純化。最后,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3 cDNA初級文庫的構建及檢測

將質量合格的日本結縷草總RNA作為模板,進行第一鏈cDNA的反轉錄合成。在E.coliDNA Ligase (10 U·μL-1)、E.coliDNA PolymeraseⅠ(10 U·μL-1)、E.coliRNaseH (2 U·μL-1)和T4 DNA Polymerase的催化下,利用合成的第一鏈cDNA作為模板合成第二鏈cDNA。將三框attB1重組接頭連接至獲得的第二鏈cDNA,隨后進行cDNA分級分離并收集。對收集到的cDNA進行BP重組反應,并將反應產物轉化到大腸桿菌DH10B細胞中。轉化階段完成后,將細胞轉移到SOC培養基中,在37℃、搖床速度為225～250 r·min-1的條件下培養60分鐘左右。隨后,將菌液原液分為兩部分,一部分原液取出進行后續的測定庫容、重組率和插入片段長度。剩余原液則加入甘油至終濃度為20%,存儲在-80℃的環境中進行長期保存。

1.4 酵母雜交cDNA文庫的構建及保存

首先,需要進行初級文庫質粒的提取,然后將提取好的質粒稀釋到300 ng·μL-1。之后,進行LR重組反應,將質粒與載體pGADT7-DEST相結合。然后進行轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞的相關實驗。最后細胞培育需要在SOC培養基上進行,用以獲得酵母雙雜交cDNA文庫。隨后,文庫質量鑒定需要取出10 μL轉化后的細菌原液進行相關實驗。將甘油加入到剩余的菌液中直至濃度達到20%,并且需要將菌液在-80℃長期存放,以備后續使用。

1.5 Y187酵母感受態細胞的制備

為了獲得Y187酵母感受態細胞,需要取少量菌株,在YPDA培養基上劃線。隨后,將其倒放在30℃培養箱中培養3～5天。接著,在YPDA培養基振蕩培養多次挑選好的酵母單菌落,直至菌液OD600達到0.4～0.5。用單獨的離心管分裝最終的菌液,然后將分裝好的菌液進行離心并把上清液棄掉,之后需要用無菌去離子水將沉淀進行重懸,再次離心后重懸沉淀需要加入TE/LiAc溶液。最后使用TE/LiAc溶液懸浮細胞,可以得到Y187酵母感受態細胞的懸浮液。

1.6 cDNA文庫轉化Y187酵母感受態細胞

首先,將cDNA文庫質粒取出5 μL,并將其轉化到制備好的Y187酵母感受態細胞中。將轉化后的細胞原液取出10 μL,分別稀釋到原來的10,100,1 000,10 000倍,然后將稀釋后的液體涂布于SD/-Leu平板上,之后在30℃培養箱中將SD/-Leu平板倒放并將其培養3～5天。最后進行轉化子的收集,并計算細胞密度和進行文庫的滴定數的確定。在SD/-Leu平板上隨機挑選24個克隆,用來鑒定菌落PCR。挑選單菌落進行PCR檢測以及瓊脂糖凝膠電泳檢測,并進行文庫重組率的相關計算。

1.7 轉錄自激活驗證

將轉化好的pGBKT7-ZjCCD7和pGBKT7載體的酵母菌液點涂在SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養基上,放入30℃培養箱中進行2～3天的培養,之后對pGBKT7和pGBKT7-ZjCCD7出現的菌落狀態進行觀察驗證,看其是否具有轉錄自激活活性。

1.8 ZjCCD7互作蛋白的篩選及驗證

按照MatchmakerTM酵母篩庫試劑盒的要求進行ZjCCD7蛋白的篩庫。將pGBKT7-ZjCCD7和pGADT7-atpG一起轉化至酵母感受態細胞中作為實驗組,并設置pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽性對照,pGBKT7-53+pGADT7-atpG,pGADT7-T+pGBKT7-ZjCCD7共同作為陰性對照,將搖好的酵母菌液在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal固體培養基上點涂,并放入30℃培養箱下進行2～3 d的培養,之后對菌落狀態進行觀察記錄。

2 結果與分析

2.1 日本結縷草mRNA分離質量良好

用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測(圖1),檢測結果顯示,純化后的mRNA條帶呈現為一條模糊的拖帶,大于500 bp的部分是該拖帶最亮的部分。該結果表明,分離純化后的mRNA沒有發生分解,且質量良好,能夠用作建庫起始樣品。

圖1 mRNA分離結果Fig.1 mRNA separation results

2.2 初步構建cDNA初級文庫

將純化后的ds-cDNA取出5 μL,用以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測結果顯示,ds-cDNA的條帶呈現為一條彌散狀,該條帶大小在250～2 000 bp之間(圖2)。表明純化后的cDNA滿足下一步建庫試驗的要求,可以用于進行后續實驗。

圖2 二鏈合成結果Fig.2 Two-strand synthesis results

2.2.1初級文庫重組率鑒定 從該克隆文庫中隨機挑選24個克隆,并將挑選好的克隆進行菌落PCR的鑒定。經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并對其重組率和插入片段長度進行了分析(圖3)。結果表明該初級文庫擁有100%的重組率,并且其平均插入片段長度在1 000 bp之上,因此該文庫符合高質量初級文庫的要求。

圖3 重組率鑒定Fig.3 Identification on the reorganization rates of primary library注:初級文庫的24 個克隆的菌落PCR鑒定Note:PCR identification on the colonies of 24 clones of primary libraries

2.2.2初級文庫庫容量鑒定 取10 μL轉化后的細菌原液,并對其進行稀釋至原來的100倍,之后從稀釋好的液體中取50 μL,并將其均勻涂布在含有卡那霉素的LB培養基上。根據公式計算得到,初級文庫總克隆數為cfu=2.6×106×4=1.04×107(圖4)。

圖4 初級文庫庫容量鑒定Fig.4 Capacity identification of the primary library

2.3 次級文庫構建

2.3.1次級文庫插入片段重組率鑒定 從文庫中隨機挑選了24個克隆,并對選取的24個克隆進行菌落PCR鑒定,還進行了重組率和插入片段長度的分析。該凝膠電泳結果顯示,隨機挑選好的24個克隆擁有100%重組率,且平均插入片段長度在1 000 bp以上(圖5)。結果表明滿足構建該酵母雜交cDNA文庫的高質量要求條件,后續的日本結縷草酵母雜交相關試驗可以使用該酵母雜交cDNA文庫。

圖5 次級文庫重組率鑒定Fig.5 Identification on reorganization rates of the secondary library注:次級文庫的24 個克隆的菌落PCR鑒定Note:PCR identification on the colonies of 24 clones of the secondary library

2.3.2次級文庫庫容量鑒定 將轉化后的細菌原液取出10 μL,并將其稀釋至原來溶液的100倍,之后在LR培養基上均勻涂布取出的50 μL稀釋好的溶液,將該培養皿倒放在恒溫培養箱中,并在第二天對其進行計數(圖6),根據公式進行計算,得到次級文庫總克隆數為cfu=4.0×106×4=1.6×107(圖6)。

圖6 次級文庫庫容量鑒定Fig.6 Capacity identification of the secondary library

2.4 cDNA文庫轉化Y187 酵母感受態細胞

取出100 μL液體,將其在稀釋度為1∶10 000的SD/-Leu培養基上均勻涂布。該培養基克隆數為300,且細胞密度大于3×107cells·mL-1(圖7)。

圖7 文庫滴度鑒定Fig.7 Titer identification on the library

隨機挑選該SD/-Leu培養基上的24個單菌落,并將這些單菌落進行擴大培養,之后完成PCR檢測(圖8)。結果顯示其中可擴增出條帶的單克隆有23個,平均插入片段長度大于1 000 bp,根據公式可得文庫重組率>95%。

圖8 酵母克隆鑒定Fig.8 Identification on the yeast clones注:酵母克隆的24個克隆的菌落PCR鑒定Note:PCR identification on the colonies of 24 clones of yeast clones

2.5 ZjCCD7自激活檢測與蛋白互作

2.5.1ZjCCD7自激活檢測 為了對構建的日本結縷草酵母文庫進行檢測,選擇類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7進行驗證。將轉化成功的pGBKT7-ZjCCD7誘餌表達載體的酵母菌株,在SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-Gal,SD/-Trp/X-α-Gal/AbA這3種缺陷固體培養上點涂并觀察生長情況。實驗結果顯示,有酵母菌落在SD/-Trp培養基上并且正常生長。而且轉入的pGBKT7-ZjCCD7酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal培養基上酵母菌落沒有顯示藍色且正常生長,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養基上沒有酵母菌落生長且無顏色變化(圖9)。因此構建成功的pGBKT7-ZjCCD7誘餌表達載體沒有自激活活性,可應用于酵母雙雜交系統的蛋白篩選試驗。

圖9 pGBKT7-ZjCCD7酵母轉化轉錄自激活檢測Fig.9 Transcriptional self-activation assay of pGBKT7-ZjCCD7 yeast transformation

2.5.2ZjCCD7互作蛋白篩選及驗證 將ZjCCD7蛋白按照MatchmakerTM酵母篩庫試劑盒的要求進行篩庫。篩選得到了28個變藍的克隆,通過初步篩選和生物信息學分析后,對其中一個陽性克隆進行了鑒定和酵母互作驗證。將pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽性對照,pGBKT7-53+pGADT7-atpG,pGADT7-T+pGBKT7-ZjCCD7作為陰性對照,pGBKT7-ZjCCD7+ pGADT7-atpG作為實驗組。將它們轉化好的酵母菌液均勻點涂在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培養基上并放入培養箱培養2～3天,之后發現陽性對照pGBKT7-53+pGADT7有菌落生長且顏色變藍,陰性對照pGBKT7-53+pGADT7-atpG和pGADT7-T+pGBKT7-ZjCCD7未見菌落生長且沒有顏色變化,作為實驗組的pGBKT7- ZjCCD7+ pGADT7-atpG在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培養基上正常生長且變藍(圖10),說明ZjCCD7與ZjatpG互作能激活GAL4酵母雙雜交系統的報告基因MEL1的表達。應用所構建的日本結縷草酵母文庫成功篩選得到了ZjCCD7的互作蛋白,這表明文庫可用于后續的日本結縷草互作蛋白篩選實驗以及功能驗證實驗。

圖10 ZjCCD7蛋白互作Fig.10 ZjCCD7 protein interactions

3 討論與結論

生物技術領域目前的各項研究已經廣泛應用了cDNA文庫,所以,構建高容量的cDNA文庫至關重要,有效研究的進行需要高容量的cDNA文庫。文庫中所含cDNA種類的完整性可用來體現文庫的代表性,文庫質量的高低可以用建庫來源組織中所表達的遺傳信息完整性來反映[13]。同時,高質量的cDNA文庫也對文庫插入片段的大小有一定要求,文庫插入片段的長度應高于0.3 kb[14],高質量的文庫插入片段應高于1 kb[15],此外文庫插入片段長度應當接近于cDNA長度,過短或過長均會造成文庫質量下降[16]。文庫質量降低是由于平均插入片段過小,而過度篩除cDNA片段則會造成初始文庫滴度過低或丟失部分基因信息[17]。本研究成功構建了高容量的日本結縷草酵母雜交cDNA文庫,可用于日本結縷草中進行互作蛋白篩選或調控網絡分析。該文庫包含豐富的cDNA克隆和完整的遺傳信息。日本結縷草為暖季型禾本科草地植物[18],其基因組大小為334 Mb,含有59 271個蛋白編碼基因[19]。構建的日本結縷草初級文庫總克隆數為1.04×107,為蛋白編碼基因的175倍,該文庫插入片段平均長度在1 000 bp以上,cDNA片段擁有>95%的重組率,滿足cDNA文庫的高質量、完整性要求條件,符合進行蛋白互作篩選的文庫要求,后續的酵母雜交試驗可以使用該cDNA文庫。

酵母雜交系統主要包括酵母雙雜交技術和酵母單雜交技術。酵母雙雜交技術可用于互作蛋白的篩選,酵母雙雜交篩選技術是確定兩個蛋白質相互作用的關鍵技術之一,具有高度靈敏性和完善的報告系統[20],酵母雙雜交技術可研究抗原與抗體的相互作用,可用作藥物作用位點的篩選,在藥物的發現和開發過程中起著重要的作用[21],也可用于蛋白和藥物相互作用以及基因組蛋白連鎖圖等方面。而酵母單雜交技術則主要用于探究蛋白質與DNA的相互作用[22-23]。本研究利用酵母雜交技術,進行了日本結縷草ZjCCD7和atpG蛋白互作篩選試驗。

構建植物cDNA文庫已成為研究基因功能最常用的技術手段之一,cDNA文庫是研究某一生物特定器官、組織和發育階段基因表達的前提和基礎,這需要在基因組水平上進行研究[24],構建成功的cDNA文庫可用于研究基因的功能、篩選互作蛋白以及探究蛋白質與DNA的相互作用。因此,高質量植物cDNA文庫的構建具有重要意義,該文庫不僅能夠深入研究植物基因和蛋白質功能,還可以用來發掘潛在蛋白功能[25]。本研究成功構建了日本結縷草cDNA文庫,為了驗證構建的日本結縷草酵母文庫,以實驗室克隆的日本結縷草類胡蘿卜素裂解雙加氧酶為誘餌,進行互作蛋白質的篩選。利用酵母雙雜交技術篩選ZjCCD7互作蛋白,最終篩選到日本結縷草ZjatpG蛋白。已知類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7(CCD7)是類胡蘿卜素降解以及獨角金內酯合成途徑中的關鍵酶,在植物生長過程中起著重要作用[26],而atpG編碼ATP合酶γ亞基與質子運輸ATP合成酶有密切的關系[27]。本研究進行的ZjCCD7和atpG蛋白互作篩選試驗,表明日本結縷草酵母文庫可應用于蛋白篩選實驗,互作結果顯示日本結縷草類胡蘿卜素裂解雙加氧酶行使功能過程可能與ATP合酶相關,相關通路的調控模式仍需更深層次的探究,從而為后續ZjCCD7的調控機制的研究奠定基礎。

本研究進行了高容量日本結縷草酵母雜交cDNA文庫的構建,日本結縷草互作蛋白的酵母雙雜交篩選和蛋白質與DNA互作的酵母單雜交試驗都可以用到該文庫,具有廣泛的應用前景。本研究成功構建了高容量的日本結縷草cDNA酵母文庫,滿足高質量、完整性的cDNA文庫要求,以該文庫的高質量和完整性作為試驗基礎,可繼續通過后續酵母雜交深入挖掘日本結縷草生長發育的基因功能。