短期施有機肥對‘川草2號’老芒麥AMF種類及分布的影響

張卓航, 蘆光新*, 周學麗,2, 王英成, 金 鑫, 鄭開福, 李晶晶, 王 杰, 劉欣悅

(1.青海大學農牧學院, 青海 西寧 810016; 2.青海省草原改良試驗站, 青海 共和 813000)

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)作為70%～80%陸生植物的專性有益共生體[1],廣泛分布于全球陸地生態系統[2-3],約占土壤微生物生物量的20%～30%[4]。AMF可以促進植物對養分的吸收[5],增加植物的抗旱性[6]、抗鹽性[7]、抗金屬毒性[8]和抗病蟲害能力[9],改變植物-植物間的相互作用,影響植物群落組成[10],調控植物群落結構和生態系統生產力[11],加速受干擾生態系統植被的恢復[12]。

有機肥替代化肥成為實現優化農業結構和提升農牧業綠色發展的重要路徑。2019年青海省確定的《全省實施化肥農藥減量增效行動總體思路和2019年試點方案》指出,從2019年起到2023年,青海省全省內種植業基本實現從數量型轉變為質量型,全面構建以綠色為導向的農業技術體系[13-14],將青海打造成綠色有機農畜產品輸出地成為一項重要的民生工程和推動青海高質量發展的重要動力。因此,在“雙減行動”和有機肥替代化肥的過程中,田間養分管理面臨著如何在滿足作物養分需求和保護植物根周與根際土壤生物多樣性之間保持平衡,從而保證農業生態系統的可持續性的巨大挑戰。前人研究表明施有機肥可以在短時間內增加土壤有機質含量,調節土壤微生物群落組成和多樣性[15],增加土壤生物活性[16],也有其他研究表明養分的富集會降低AMF的豐度和多樣性[17-18]。

AMF的多樣性決定了農業生態系統的功能,AMF的多樣性越高,對提高牧草產量、營養、生物多樣性和生態系統穩定性的重要性就越大[19]。然而,在高寒地區此類研究目前仍然較少,關于在高寒地區短期施有機肥對土壤AMF群落結構的影響結果與其他地區結果是否一致尚未可知。因此,本試驗采用高通量測序技術探究短期施有機肥對高寒地區禾本科牧草土壤AMF群落多樣性、組成及分布特征的影響,旨在為綠色發展背景下高寒地區農業生態系統的可持續性發展提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地概況

試驗地位于青海省鐵卜加草原改良試驗站,東經99°35′,北緯37°05′,海拔3 270 m。年平均氣溫-0.7℃,最熱月(7月)平均氣溫17.5℃,最冷月(1月)平均氣溫-22.6℃,極端溫度-34.3℃,無霜期平均為78.7 d,無絕對無霜期,日照時數2 670 h,≥0℃年積溫1 331.3℃,年降水量368.11 mm,年蒸發量為1 495.3 mm,相對濕度58%。

1.2 試驗設計

試驗于2020年5月開始,在禾本科牧草種植田進行田間試驗,設置有機肥(F)與不施肥(CK)處理,每個處理3次重復,小區隨機排列,每個小區面積15 m2(3 m×5 m),有機肥在種植時作為基肥一次性施入,施肥處理小區施有機肥量為7.88 kg(施肥量依據有機肥袋標準)。

1.3 試驗材料

牧草品種:‘川草2號’老芒麥(ElymussibiricusL.‘Chuancao No.2’)(購自于四川省川草生態科技有限責任公司)。

有機肥:以富含有機質的農作物秸稈和家禽糞便為主要原料并添加生物發酵劑,有機質含量≥45%,N+P2O5+K2O≥5%,pH值為5.5～8.5(購自于四川農業大學資源學院)。

1.4 研究方法

1.4.1樣品采集 土壤樣品于2020年9月采集,在每個小區中,隨機選擇長勢均勻的2個1 m×1 m的樣方進行采樣,共12個樣方。選好樣方后,齊地面剪去植株的地上部分后,用無菌鐵鏟垂直于地面挖出30 cm深度的根系,從根系抖落的土作為根周土,用無菌刷子刷下粘附在根上的土作為根際土,均質化并過無菌篩(<2 mm)以去除根部及其他植物材料。將土壤樣品于4℃車載冰箱運至實驗室,分為兩部分,一部分用于理化性質的測定,另一部分儲存于-80℃冰箱用于DNA提取。

1.4.2土壤理化性質測定 土壤樣品風干、磨碎,過0.25 mm孔徑網篩后進行土壤養分測定。土壤總氮(Total nitrogen,TN)含量用凱氏定氮法測定;土壤銨態氮(Ammonium nitrogen,NH4-N)含量用靛酚藍比色法測定;土壤硝態氮(Nitrate nitrogen,NO3-N)含量用紫外分光光度法測定;有機質(Organic matter,OM)含量用重鉻酸鉀氧化-油浴加熱法測定;土壤pH值用pH計(pHS-3C)測定。

1.4.3根周與根際土壤AMF群落多樣性和組成測定 將裝有樣品的無菌管從-80℃冰箱中取出解凍,在超凈工作臺中取出10 g土壤樣品,用土壤DNA試劑盒(MOBIO Laboratories,Carlsbad,CA,美國)提取24個土壤樣本的微生物總DNA。用Nanodrop2000測定提取DNA的濃度與純度,濃度均在20 ng·μL-1以上,A260/A280為1.8～2.0。利用特定引物(上游引物gITS5.8F:5′-AACTTTYRRCAAYGGATCWCT-3′;下游引物ITS4R:5′-AGCCTCCGC-TTATTGATATGCTTAART-3′)對土壤樣本進行ITS rRNA基因擴增、建庫并送至廣州美格基因科技有限公司在Illumina Miseq平臺測序。

1.5 數據處理

利用中科院環境所鄧曄老師課題組的Galaxy分析平臺(http://mem.rcees.ac.cn:8080/)對微生物原始數據進行分析,使用Trim Primer去除正反向引物,FLASH進行正反序列拼接,Trim by sequence length對序列進行篩選與修剪,保留長度在245～265 bp的目的序列。目的序列通過Unoise的方法進行操作分類單元(Operational taxonomic units,OTU)歸類,生成原始OTU表,為了使每個樣品序列數相同,以Resample OTU table對數據進行重抽,重抽得到的OTU進行后續分析。對重抽的OTU表用RDP分類數據庫進行注釋。通過物種組成和FUNGuild[20]篩選出AMF的OTU,進行后期統計分析。通過多重比較分析(LSD)和T檢驗對土壤理化性質和AMF的α多樣性進行顯著性分析。通過基于Bray-Curtis距離矩陣的非度量多維尺度分析(Non-metric multidimensional scaling,NMDS)、主坐標分析(Principal coordinate analysis,PCoA)和不相似檢驗(dissimilarity test)對CK與F的土壤AMF群落進行β-多樣性差異分析。通過Mentel檢驗和Pearson分析對根周和根際土壤AMF菌屬與環境因子進行相關性分析。使用Microsoft Excel 2021,IBM SPSS Statistics 20,Origin 2023,RStudio軟件分別進行整理數據、統計分析以及結果的可視化。

2 結果與分析

2.1 施用有機肥后土壤理化性質的變化

施有機肥改變了土壤養分含量,與CK相比,有機肥顯著增加了土壤總氮含量(P<0.05),降低了銨態氮、硝態氮含量和土壤pH值,但變化均不顯著(表1)。

表1 土壤理化性質Table 1 Soil physical and chemical properties

2.2 施用有機肥后根周與根際土壤AMF種類和數量的變化

24個樣本經高通量測序共獲得8 145 681條序列,在97%的相似性水平下,得到2 733個真菌OTU,均能被FUNGuild注釋,其中篩選出43個AMF的OTU。對根周和根際CK與F間共有和獨有OTU進行可視化(圖1),結果顯示,四個處理中AMF共有15個OTU,占全部OTU的34.9%;根周土壤CK與F中AMF共有20個OTU,占全部OTU的46.5%;根際土壤CK與F中AMF共有18個OTU,占全部OTU的41.9%;根周施肥土壤中AMF(ZF)擁有最多獨有OTU(4個),占全部OTU的9.3%。

圖1 不同處理組AMF群落共有和獨有OTU韋恩圖Fig.1 Common and unique OTU Venn diagram of soil AMF community in different treatment groups注:JCK為不施肥根際;JF為施肥根際;ZCK為不施肥根周;ZF為施肥根周。下同Note:JCK stand for rhizosphere without fertilization;JF stand for rhizosphere with application of organic fertilizer;ZCK stand for around the root without fertilization;ZF stand for around the fertilized root. The same as below

檢測總AMF相對豐度在真菌中所占比例的變化,結果表明,CK中,根周總AMF相對豐度低于根際總AMF相對豐度;施有機肥后,根周與根際土壤中總AMF的相對豐度均顯示增加,根周顯著增加。因此,短期施有機肥可以增加根周與根際總AMF的相對豐度(圖2)。

圖2 根周和根際土壤總AMF相對豐度變化Fig.2 Changes in relative abundance of total AMF around the root soil and in rhizospheric soil注:*為相關性在0.05水平顯著Note:* is significant at the 0.05 level

科水平上,共檢測到土壤AMF有6個科(圖3a):近明囊霉科(Claroideoglomeraceae,51.59%～69.02%)、內養囊霉科(Entrophosporaceae,17.19%～23.72%)、球囊霉科(Glomeraceae,2.89%～12.34%)、未知菌科(Unclassified,2.42%～11.98%)、散囊菌科(Diversisporaceae,0.32%～2.15%)和Leotiomycetes incertae sedis(0%～0.52%)。土壤AMF群落中的優勢菌科為近明囊霉科,其相對豐度大于50%;與CK相比,施有機肥后,根周與根際AMF群落中球囊霉科相對豐度顯著增加,近明囊霉科相對豐度降低,根周內養囊霉科相對豐度增加,根際Leotiomycetes incertae sedis消失。

屬水平上,共檢測到土壤AMF有7個屬(圖3b):近明球囊霉屬(Claroideoglomus,51.59%～69.02%)、內養囊霉屬(Entrophospora,17.19%～23.72%)、未知菌屬(Unclassified,2.42%～11.98%)、球囊霉屬(Glomus,2.43%～12.34%)、管柄囊霉屬(Funneliformis,0%～9.17%)、多樣囊霉屬(Diversispora,0.32%～2.15%)、錘苔舌菌(Leohumicola,0%～0.52%)。土壤AMF群落中的優勢菌屬為近明球囊霉屬,相對豐度大于50%;與CK相比,施有機肥后,根周和根際AMF群落中近明球囊霉屬相對豐度降低,分別降低了7.41%和13.78%;根際球囊霉屬相對豐度顯著增加,管柄囊霉屬和錘苔舌菌消失;根周內養囊霉屬、球囊霉屬和多樣囊霉屬的相對豐度降低,出現管柄囊霉屬。

2.3 施用有機肥后根周與根際土壤AMF物種多樣性的變化

老芒麥根周和根際土壤AMF群落α多樣性分析發現,與CK相比,施有機肥顯著增加了根周土壤AMF群落的Shannon指數(P<0.05),極顯著增加了豐富度和Chao1指數(P<0.01);根際土壤AMF群落的α多樣性均無顯著變化;根周土壤AMF群落豐富度和Chao1 指數顯著高于根際土壤。該結果表明短期施用有機肥對土壤AMF多樣性的影響表現為根周大于根際(圖4)。

圖4 根周和根際土壤AMF群落α多樣性Fig.4 The α diversity of AMF community around the root soil and in rhizospheric soil注:*為相關性在0.05水平顯著,**為相關性在0.01水平顯著Note:* is significant at the 0.05 level,and ** very significant at the 0.01 level

2.4 根周與根際土壤AMF群落結構分析

對老芒麥根周和根際土壤AMF群落進行NMDS分析、主坐標分析,并進行不相似檢驗分析驗證。如圖5、圖6和表2所示,CK中根周土壤AMF群落和根際土壤AMF群落間無明顯的空間分布,即根周與根際土壤AMF群落間不存在顯著差異。施有機肥后,根周和根際土壤中AMF在圖5和圖6中的距離均較近,說明施有機肥前后根周與根際土壤中AMF群落結構無較大差異。Bray-Curtis距離的不相似檢驗結果中,各處理組間均無顯著差異,表明高寒人工草地中,老芒麥根周和根際土壤中AMF的群落結構較為穩定,不易受短期施有機肥的影響。

圖6 不同處理組AMF的主坐標分析Fig.6 Principal coordinate analysis of AMF in different treatment groups

表2 基于AMF群落Bray-Curtis距離的不相似檢驗Table 2 Dissimilarity test of E.sibiricus based on Bray-Curtis distance of AMF community

2.5 根周與根際土壤AMF與環境因子相關性分析

老芒麥土壤AMF與環境因子的相關性分析和Mantel檢驗結果顯示(圖7),優勢菌屬近明球囊霉屬相對豐度與硝態氮含量呈顯著正相關關系(P<0.05);內養囊霉屬相對豐度與牧草鮮重和干重呈顯著正相關關系(P<0.05),與硝態氮含量呈極顯著正相關關系(P<0.01);未知菌屬相對豐度與pH值呈顯著正相關關系(P<0.05),與牧草鮮重和干重呈極顯著正相關關系(P<0.01);錘苔舌菌相對豐度與總氮含量呈顯著正相關關系(P<0.05)。老芒麥土壤AMF的多樣性與環境因子Pearson相關性分析結果顯示(表3),土壤AMF的Shannon指數與總氮含量呈顯著正相關關系(P<0.05),Inv_Simpson指數與pH值和牧草鮮重呈極顯著負相關關系(P<0.01)。

圖7 土壤AMF與環境因子相關關系圖Fig.7 Correlation diagram of soil AMF and environmental factors注:TN為總氮;NH4-N為銨態氮;NO3-N為硝態氮;OM為有機質;frseh.weight為牧草鮮重;dry.weight為牧草干重。圖中AMF與環境因子間連線反映了它們之間的相關性,連線越粗,相關性越強Note:TN stands for total nitrogen;NH4-N stands for ammonium nitrogen;NO3-N stands for nitrate nitrogen;OM stands for organic matter;frseh.weight stands for fresh weight of forage grass;dry.weight stands for dry weight of forage grass. The connection between AMF and environmental factors in the diagram reflects the correlation between them. The thicker the connection line,the stronger the correlation relation

表3 根周與根際土壤AMF的α多樣性與環境因子Pearson相關性分析Table 3 Pearson correlation analysis between α diversity of AMF around the root and rhizospheric soil and environmental factors

3 討論

3.1 有機肥對根周與根際土壤AMF豐度和多樣性的影響

AMF作為植物的專性生物營養物質,在營養元素循環、土壤碳固持和生態系統穩定性等方面具有重要作用[21-22]。研究結果表明,有機肥顯著增加了老芒麥根周土壤AMF群落物種豐富度和生物多樣性(圖4),該結果與張琳[23]和VAN等[24]的結果一致。有機肥通過產生刺激菌絲生長的物質,增加AMF群落豐富度和多樣性,進而增加植物的生物多樣性、養分捕捉能力和生產力[23-24]。施有機肥后,老芒麥根周土壤AMF群落多樣性和物種豐富度顯著增加,根際土壤AMF群落多樣性無顯著變化,物種豐富度降低,根周土壤結果與江尚燾等[25]的結果一致,根際土壤結果與其有一定差異(圖4)。施有機肥會提高AMF的侵染率、孢子密度[26]、多樣性和物種豐富度[27],同時也會對AMF群落產生負面影響[28]。結果出現差異的原因可能是施肥時間長短不同、地區不同的AMF組成存在地理差異[27]。

3.2 有機肥對根周與根際土壤AMF群落結構的影響

施有機肥會改變土壤理化性質,影響土壤微生物群落結構[29],進而影響老芒麥根周和根際AMF群落結構變化。本研究結果表明,有機肥降低了老芒麥根周和根際土壤中AMF的優勢菌屬近明球囊霉屬的相對豐度(圖3b),該結果與劉文娟等[30]的研究結果有機肥會降低土壤AMF優勢菌屬的相對豐度一致。同時,有機肥改變了根周和根際土壤中AMF的物種組成,根際土壤中的管柄囊霉屬轉移到了根周土壤中(圖3b)。根周和根際土壤AMF群落的NMDS分析(圖5)、PCoA(圖6)和不相似檢驗(表2)結果均顯示四個處理組中AMF群落間不存在顯著差異。該結果表明有機肥對根周和根際土壤中AMF群落結構無顯著影響,但會對根周和根際土壤中AMF群落的物種組成造成影響。

3.3 根周與根際土壤AMF與環境因子的關系

AMF群落與環境因子的研究表明,施有機肥增加了土壤養分,進而引起AMF群落多樣性的變化[31]。在不同生態系統中,環境因子特別是pH值、氮和微量元素對AMF群落具有顯著影響[32]。本研究Pearson相關性分析(表3)結果顯示,土壤pH值和牧草鮮重對AMF群落多樣性影響最大,pH值和牧草鮮重與Inv_Simpson指數呈極顯著負相關關系。曹敏等[33]的結果為土壤pH與Shannon指數呈正相關,與本實驗結果相反,出現差異的原因與土壤酸堿性不同有關,曹敏等的研究樣點土壤pH均為酸性,而本研究中土壤pH均為中性。環境因子與AMF菌屬之間的相關性(圖7)結果顯示,內養囊霉屬和未知菌屬相對豐度受環境因子影響最大,硝態氮含量、牧草鮮重和干重為主要影響因子。近明球囊霉屬相對豐度與總氮和硝態氮含量呈負相關關系,球囊霉屬相對豐度與pH值呈正相關關系,該結果與楊文瑩[34]和周靜怡等[35]結果一致,但部分結果也存在差異,球囊霉屬相對豐度與總氮和有機質含量呈負相關關系,多樣囊霉屬相對豐度與總氮含量呈負相關關系,出現該差異的原因與施用有機肥時間較短、試驗地海拔高、氣壓和溫度低對部分AMF生長產生抑制作用有關[36]。

4 結論

本研究利用高通量測序對高寒地區‘川草2號’老芒麥短期施有機肥的根周和根際土壤AMF群落多樣性和組成,以及其與環境因子的相關性分析,老芒麥共生的AMF共有7個屬,根周土壤中AMF的物種數大于根際土壤。土壤pH值和牧草鮮重對AMF群落多樣性影響最大;施有機肥顯著增加土壤總氮,與土壤AMF多樣性呈顯著正相關關系;有機肥增加了根周土壤AMF的多樣性和物種豐富度,但降低了根際土壤AMF的物種豐富度,并且有機肥的添加降低了根周和根際土壤AMF優勢菌屬近明球囊霉屬(Claroideoglomus)的相對豐度。本研究解析了在高寒地區短期施有機肥對禾本科牧草根周和根際AMF群落和多樣性的影響,為深入了解高寒地區牧草種植地田間養分管理和AMF多樣性之間關系提供理論依據。