美洲大蠊提取液對兔角膜上皮損傷修復影響的實驗研究

周春陽 袁正 李依靜 祝麗婷 梅波

角膜是一種透明的無血管組織,可以起到結構屏障的作用,保護眼睛免受感染[1]。同時與淚膜一起,為眼睛提供了光滑的屈光界面,角膜屈光力約占眼球總屈光力的70%。上皮層是角膜的最外層,在眼睛的免疫、保護和結構穩定性方面具有重要功能。角膜上皮損傷是指由于各種因素導致的角膜上皮屏障功能與完整性被破壞,引起角膜上皮細胞層部分或全層缺失的病理狀態[2]。臨床上可表現為角膜上皮彌漫性點狀脫失或糜爛,嚴重者可導致角膜基質病變,影響視功能,甚至失明。目前,全球盲人估計為3600萬,另有2.17億人患有中度至重度視力障礙。在2.53億盲人或視力受損者中,約617萬人的病例可歸因于角膜原因[3]。局部藥物使用是目前公認的治療角膜上皮損傷最直接有效的手段,但臨床常使用的人工淚液、生長因子類和蛋白提取類滴眼液的治療效果不盡如人意,尋找更加有效的藥物治療角膜上皮損傷具有重要意義。美洲大蠊屬昆蟲綱,蜚蠊目,蜚蠊科,俗稱蟑螂。蜚蠊的藥用在中國現存最早的藥學專著《神農本草經》就有記載:“主血瘀,瘕堅,寒熱,破積聚,咽喉痹,內寒無子”。現代醫學研究發現美洲大蠊提取液(periplaneta americana extract,PAE)在治療許多涉及組織修復的疾病中起著至關重要的作用。本研究通過建立兔角膜上皮損傷模型,觀察PAE對兔角膜上皮損傷修復的潛在影響,進一步明確治療效果,為角膜上皮損傷的治療提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 32只標準實驗用普通級健康雄性新西蘭大白兔,體重約2～2.5 kg,4～6月齡。動物飼養員使用專用飼料每日定時定量投食喂養,飲水自由,適應性飼養1周。本實驗經成都中醫藥大學動物實驗倫理委員會審查通過(編號:2022-34)。

1.1.2主要試劑和儀器 美洲大蠊提取液(四川好醫生攀西藥業有限責任公司),人表皮生長因子滴眼液(桂林華諾威基因藥業有限公司),生理鹽水(四川科倫藥業股份有限公司),眼科裂隙燈顯微鏡檢查儀(重慶上邦醫療設備有限公司),手術顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1兔角膜上皮損傷模型建立 采用乙醇法建立兔角膜上皮損傷模型[4]。大白兔稱重后,3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經兔耳緣靜脈注射行全身麻醉。兔右眼結膜囊內滴用鹽酸奧布卡因滴眼液行局部表面麻醉,放置開瞼器,充分暴露兔眼角膜。在角膜中央放置直徑7 mm的角膜環鉆,于角膜環鉆內滴入提前配制好的體積分數20%乙醇溶液,作用60 s后移除環鉆,使用生理鹽水進行沖洗。使用角膜上皮刮刀逐步刮除角膜上皮。術畢進行熒光素鈉染色,并拍照記錄染色范圍,確認角膜上皮缺損呈圓形,符合后續實驗標準。所有麻醉均由同一人完成,所有角膜上皮損傷模型均由同一人完成。

1.2.2實驗分組及干預 造模完成后,隨機選擇其中2只實驗兔即刻行角膜熒光鈉素染色和裂隙燈顯微鏡檢查,為即時(0 h)組。該組實驗兔在完成眼前節照相后通過空氣栓塞法處死并取出角膜,置于甲醛溶液中固定。剩余30只實驗兔隨機分為PAE組、人表皮生長因子(human epidermal growth factor,hEGF)滴眼液組和生理鹽水(normal saline,NS)組,每組10只。各組滴用對應滴眼液進行干預,滴眼頻率為每天4次,每次間隔4小時,每次1～2滴。同時白天使用左氧氟沙星滴眼液、夜間使用妥布霉素眼膏預防感染。

1.2.3一般情況觀察 在造模后12、24、36、48、72 h使用裂隙燈顯微鏡對各組實驗兔眼部情況進行觀察評估,主要觀察內容包括結膜充血、眼瞼腫脹程度、有無分泌物等情況,評估是否出現眼部感染、角膜上皮反復剝脫等異常情況。

1.2.4角膜上皮損傷圖像的攝取及分析 造模后0、12、24、36、48、72 h,使用裝配照相機的裂隙燈顯微鏡進行圖像的攝取。隨后,在兔眼結膜囊內滴入熒光素鈉進行染色,在鈷藍光下行眼前節拍照記錄角膜熒光染色情況。使用Image-J軟件打開角膜熒光染色圖像,沿角膜上皮缺損區邊緣進行測量,獲取各組不同時間點的角膜染色面積,并計算角膜上皮修復速率和角膜上皮愈合率。角膜上皮修復速率=上皮修復面積(mm2)/修復時間(h);角膜上皮愈合率=(0 h染色面積-觀察時染色面積)/0 h染色面積×100%。采用SPSS 26.0統計軟件對數據進行統計學分析。

1.2.5角膜組織病理學觀察 各組分別于造模后24、48、72 h采取抽簽法選取3、3、4只實驗兔,使用空氣栓塞法處死后取下角膜組織,置于甲醛溶液固定。所有固定好的角膜組織(含0 h組)進行脫水、石蠟包埋、切片后,采用蘇木精-伊紅染色法進行處理,觀察比較各組不同時間點角膜上皮缺損區的大小、細胞形態結構和排列情況。

2 結果

2.1 一般情況

用藥后12、24、36、48、72 h,三組兔眼均未觀察到明顯的結膜充血、眼瞼腫脹、分泌物等情況,均未出現角膜感染、角膜上皮反復剝脫等異常情況,見圖1。

圖1 各組兔眼前節圖像(12.5×)

2.2 角膜上皮修復結果

所有兔眼角膜上皮均在72h內完全修復,其中PAE組所有兔眼角膜上皮均在48h內完全修復,見圖2。進一步對比發現,PAE組中有2只實驗兔角膜上皮在36h內完全修復;同樣的情況也出現在hEGF滴眼液組,為1只。而這種個別角膜上皮修復較快的情況并沒有出現在NS組。

圖2 三組不同時間點角膜熒光染色后眼前節圖像(12.5×)

2.2.1三組角膜上皮修復速率比較 通過計算單位時間內角膜上皮修復面積,分析對比各組兔眼角膜上皮修復速率。發現PAE組角膜上皮修復速率最快,為1.37±0.19 mm2/h;hEGF滴眼液組次之,為1.22±0.15 mm2/h;NS組最慢,為1.00±0.18 mm2/h。單因素方差分析結果顯示,組間差異有統計學意義(F=7.487,P=0.005)。進一步組間兩兩比較結果顯示,PAE組與hEGF滴眼液組的角膜上皮修復速率差異無統計學意義(t=1.621,P=0.123);PAE組與NS組的角膜上皮修復速率差異有統計學意義(t=3.860,P=0.001);hEGF滴眼液組與NS組的角膜上皮修復速率差異有統計學意義(t=2.303,P=0.034),見圖3。

圖3 三組角膜上皮修復速率比較注:ns:差異無統計學意義;*:P<0.05;**:P<0.01。

2.2.2三組角膜上皮愈合率比較 對角膜上皮愈合率進行統計分析發現,在造模后12、24、36、48 h,PAE組的角膜上皮愈合率均最高,hEGF滴眼液組次之,NS組最低。所有兔眼角膜上皮愈合率在造模后72 h均為100%。單因素方差分析結果顯示造模后12、24 h,組間差異均無統計學意義(F=1.668、1.656,P=0.218、0.220),見圖4、表1。造模后36、48 h,組間差異均有統計學意義(F=4.305、5.938,P=0.037、0.015);進一步兩兩比較結果顯示,PAE組與hEGF滴眼液組的角膜上皮愈合率差異均無統計學意義(t=0.229、0.802,P=0.823、0.437);PAE組與NS組的角膜上皮愈合率差異均有統計學意義(t=2.783、3.340,P=0.016、0.005);hEGF滴眼液組與NS組的角膜上皮愈合率差異均有統計學意義(t=2.254、2.477,P=0.032、0.028),見圖5、表1。

表1 三組不同時間點角膜上皮愈合率比較

圖4 三組12、24 h角膜上皮愈合率比較注:ns:差異無統計學意義。

圖5 三組36、48h角膜上皮愈合率比較注:ns:差異無統計學意義;*:P<0.05;**:P<0.01。

2.3 組織病理學檢查結果

角膜組織病理學檢查結果顯示,正常角膜組織上皮細胞排列有序,上皮細胞之間、上皮細胞與基底膜之間連接緊密。在角膜上皮損傷模型中,可以看到上皮細胞層的缺失,基底膜與基質層完整,基質層膠原纖維均勻規則且排列有序,見圖6。角膜上皮損傷后24 h,可見三組角膜上皮層均未完全修復,上皮細胞逐漸移行填補缺損區域。角膜上皮損傷后48h,PAE組上皮細胞已經完全覆蓋缺損區域,但此時的上皮細胞層較薄,上皮細胞之間連接較為疏松;hEGF滴眼液組和NS組上皮細胞均未完全覆蓋缺損區域,且相比而言NS組的角膜上皮缺損區域更大。角膜上皮損傷后72h,hEGF滴眼液組和NS組上皮細胞均已經完全覆蓋缺損區域。對三組角膜上皮層厚度進行比較發現,PAE組上皮細胞層最厚,與正常角膜上皮細胞層厚度接近,且上皮細胞之間排列更加緊密;hEGF滴眼液組次之;NS組最薄,見圖7。

圖6 角膜組織病理切片(100×)(正常角膜(左)、角膜上皮損傷模型(右))

圖7 三組24、48、72 h角膜組織病理切片(100×)

3 討論

角膜是暴露在外部環境中眼睛的一部分,最有可能因各種因素而受損。角膜上皮是一種可再生的組織,位于角鞏膜交界處的角膜干細胞為上皮再生提供終生的增殖細胞供應[5-6]。角膜上皮創面愈合的過程包括兩個不同的階段:初始潛伏期和閉合期[7-8]。整個過程中,嚴密調控的交互信號級聯反應涉及愈合的角膜上皮、淚液、淚腺、角膜神經、角膜基質細胞和骨髓來源的細胞,以及它們產生的細胞因子、生長因子和其他調節因子[9-10]。有助于重建上皮完整性和恢復角膜動態平衡,進而保持角膜的透明度和良好的視力。中醫稱角膜為黑睛,角膜屬肝,為風輪。角膜上皮損傷屬于黑睛生翳的范疇,中醫認為黑睛生翳應多從肝論治,同時輔以退翳明目治療。治療黑睛生翳主要通過以下途徑:一是祛風熱泄肝火以祛除病因;二是補其不足以恢復正氣驅邪外出;三是收斂固澀以縮小病灶;四是活血以消散局部瘀滯[11]。

美洲大蠊性寒味咸,作為一味中藥材,無論是中藥散劑還是美洲大蠊的提取物,其在疾病治療中均發揮著重要作用,如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強免疫功能、促進組織修復和傷口愈合等[12]。現代醫學研究發現PAE能夠激活免疫細胞,促進壞死組織脫落,肉芽組織生長。可以通過調節與細胞增殖、纖維化形成、再上皮化和重塑相關基因的表達來促進傷口愈合[13]。對皮膚組織、腸道粘膜的損傷修復具有良好的促進作用,被廣泛用于外傷、潰瘍、燙傷創面,并取得了顯著療效。而角膜和皮膚都是提供身體外部屏障的器官,這兩個組織都發展了保護機體免受廣泛外部威脅的內在機制,同時也使組織完整性和器官特異性功能得以快速恢復。皮膚創傷修復的研究揭示了再生生物學中的基本原理,皮膚屏障被破壞后,炎癥細胞的涌入、肌成纖維細胞的分化、細胞外基質的合成和瘢痕的形成在角膜和皮膚傷口愈合中呈現平行的修復機制。皮膚和角膜創傷修復反應的細胞和分子網絡存在相似性[14]。

本次動物實驗的研究方向,是通過乙醇法建立新西蘭大白兔角膜上皮損傷模型,探索PAE對兔角膜上皮損傷修復的影響,尋找更加安全有效的藥物來解決目前角膜創面愈合所面臨的問題。本研究中,在使用PAE干預后的多個時間點內,所有兔眼均未觀察到明顯的結膜充血、眼瞼腫脹、分泌物等情況,沒有角膜感染、角膜上皮反復剝脫等異常情況發生。表明該藥物作用于角膜創面溫和無刺激,這與PAE應用于皮膚組織、腸道粘膜的損傷修復效果相似,均沒有出現明顯的不良反應[15-16]。與NS組相比,PAE組的角膜上皮修復速率更快;在干預后36、48 h,PAE組的角膜上皮愈合率均顯著高于NS組。表明PAE能夠促進角膜上皮損傷的修復,縮短角膜創面完全愈合的時間。組織病理學檢查結果顯示,干預后72 h, PAE組角膜上皮層厚度相較于hEGF滴眼液組和NS組更厚,上皮細胞之間排列更加緊密,表明PAE能促進角膜上皮損傷后角膜上皮的重塑。

綜上所述,PAE可以通過減輕創面炎癥反應、提高免疫和抗氧化活性、調節細胞生長因子的表達、調節與傷口愈合相關的信號通路等途徑促進皮膚組織修復[17],而皮膚和角膜創傷修復反應的細胞和分子網絡存在相似性,因此PAE可能通過相似的作用機制來促進角膜上皮損傷的修復。目前的基礎研究和臨床實驗主要針對PAE促進皮膚組織、胃腸道黏膜創面修復開展研究,尚無PAE應用于角膜創傷修復的報道。本研究結果表明,PAE對角膜組織的創傷修復同樣具有促進作用,為角膜損傷的治療提供了新的思路。

本研究結果雖表明PAE對角膜組織的損傷修復具有促進作用,但是本研究的樣本量相對較少,PAE促進角膜上皮損傷修復的效果與hEGF滴眼液組相比差異無統計學意義。本研究中所使用的美洲大蠊提取液成分復雜,具體的有效成分和作用機制還需要進一步研究明確。此外,研究中所使用的美洲大蠊提取液濃度單一,藥物的最佳有效濃度也需要擴大樣本量,進一步探索。