過表達Sirt3通過Keap1/Nrf2通路調控高糖應激誘導的腎小管上皮細胞衰老*

王自強， 王穎， 趙坤霄， 王保興， 李英△

（1河北醫科大學第三醫院腎內科，河北 石家莊 051000；2海南醫學院第一附屬醫院腎內科，海南 海口 570102）

高糖誘導細胞產生過多的活性氧（reactive oxygen species， ROS），從而加速糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）的進展［1-2］。過量的ROS產生細胞毒性，破壞蛋白質和DNA，激活DNA損傷反應，誘導應激性衰老［3］。既往研究表明，在DN早期，腎小管上皮細胞即處于持續氧化應激狀態，繼而呈現增生、肥大等應激性衰老過程［4］。

沉默信息調節因子（silent information regulator，sirtuin/Sirt）家族屬于第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）驅動其去乙酰化酶活性［5］。在哺乳動物中，已鑒定出7個Sirt2同源物（Sirt1~7），在生物調控機制和亞細胞定位上各存在差異。Sirt3定位于線粒體，參與衰老相關的病理過程，如心血管和神經退行性疾病、代謝綜合征等［6］。新近研究表明，Sirt3通過抗氧化機制發揮抗衰老作用［7］。我們前期研究表明，高糖環境下HK-2細胞中Sirt3的表達顯著降低［8］。通過上調Sirt3的表達可抑制高糖誘導的氧化應激和細胞凋亡過程［9］。Kelch樣ECH關聯蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1， Keap1）/核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）通路是調控氧化還原平衡的重要信號通路，而Nrf2介導的抗氧化途徑被破壞是導致細胞衰老的驅動力［10］。那么，Sirt3在高糖誘導的應激性衰老的過程中是否也起到保護作用，Keap1/Nrf2通路是否參與該過程，值得進一步探索。本研究擬觀察Sirt3在高糖刺激誘導的氧化應激和應激性衰老中的作用，并進一步探討其作用是否是通過影響Keap1/Nrf2通路的活性來實現的。

材料和方法

1 試劑耗材

D-葡萄糖（Sigma）；DMEM培養基、Lipofectmine 3000和P3000（Invitrogen）；β-actin抗體（Proteintech）；Sirt3、P16、P21、Nrf2、血紅素加氧酶（heme oxygenase 1， HO-1）、醌氧化還原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1， NQO1）、Keap1和histone H3抗體（Abcam）；pCMV3載體質粒和pCMV3-Sirt3質粒（Sino Biological）；衰老相關β-半乳糖苷酶（senescenceassociated β-galactosidase， SA-β-Gal）染色試劑盒和ROS測定試劑盒（Solarbio）；Nrf2抑制劑ML385（Med-ChemExpress）；反向轉錄系統和qPCR Master Mix（Promega）；細胞核/質分離試劑盒（Invent Biotechnologies）。

2 細胞培養與分組

人近端小管上皮細胞HK-2細胞（American Type Culture Collection），培養環境：37 ℃，5% CO2， 95%空氣。當細胞生長至60%左右時，于指定時間點按照細胞分組給予不同的刺激。細胞分組1：擬觀察HK-2細胞在高糖環境下培養6、12、24、48、72 h時相關指標表達的變化。細胞分為正常糖（normal glucose，NG； 葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）對照組、甘露醇高滲對照（甘露醇濃度24.5 mmol/L，葡萄糖濃度5.5 mmol/L）組和高糖（high glucose，HG；葡萄糖濃度為30 mmol/L）組，分別培養6、12、24、48、72 h。細胞分組2：為了觀察過表達Sirt3對高糖環境下HK-2細胞氧化應激、應激性衰老及相關通路的影響，將細胞分為NG（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）組、HG（葡萄糖濃度為30 mmol/L）組、高糖+空載質粒轉染（HG+vector）對照組、高糖+轉染Sirt3質粒（HG+Sirt3）組，各組均刺激48 h。細胞分組3：為了研究阻斷Keap1/Nrf2通路后，過表達Sirt3對高糖環境下HK-2細胞應激性衰老等蛋白表達的影響，將細胞分為NG（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）組、HG（葡萄糖濃度為30 mmol/L）組、HG+Sirt3組、高糖+轉染Sirt3質粒+ML385（HG+Sirt3+ML385）組，各組均在刺激48 h后，進行相關檢測。

3 實驗方法

3.1 SA-β-Gal染色 使用SA-β-Gal染色試劑盒檢測細胞衰老。HK-2細胞經相應刺激后，PBS洗滌兩次，室溫下4%甲醛固定15 min， PBS洗滌，用1 mL新鮮制備的SA-β-Gal染色液［包含溶液A（10 μL）、溶液B（10 μL）、染色溶液C（930 μL）和X-Gal溶液（50 μL），終濃度為1 mg/mL］于37 ℃無CO2培養箱中孵育過夜。普通光學顯微鏡下觀察。

3.2 細胞內ROS檢測 HK-2細胞以約1×106的密度傳代至6孔板，進行細胞爬片，予不同刺激結束后。采用活性氧檢測試劑盒，用10 μmol/L 2′、7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCHF-DA）檢測細胞內ROS水平。具體步驟：PBS洗滌細胞，用預先配制的DCFHDA染色30 min，PBS避光清洗，于熒光顯微鏡下觀察。綠光熒光強度與ROS水平呈正比。

3.3 Western blot檢測相關蛋白的表達 HK-2細胞刺激結束后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，核蛋白提取使用細胞核/質分離試劑盒，BCA法測定蛋白濃度，蛋白質樣品中加入SDS緩沖液，100 ℃變性7 min，-20 ℃保存。采用8%~12%的SDS-PAGE進行蛋白分離，轉膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h。4 ℃過夜孵育Ⅰ抗 （兔抗Sirt3、HO-1、P16、P21、Keap1及Nrf2多克隆抗體均1∶1 000稀釋，兔抗NQO1多克隆抗體1∶10 000稀釋，兔抗β-actin多克隆抗體1∶2 000稀釋）。次日，TBST洗滌（3×15 min），37 ℃條件下孵育Ⅱ抗（1∶5 000） 1 h，TBST洗滌（3×15 min）。新鮮配置ECL發光液，Odyssey FC成像系統顯色，ImageJ軟件分析。

3.4 RNA提取及RT-qPCR分析 TRIzol試劑提取細胞總RNA，cDNA試劑盒合成cDNA，采用qPCR Master Mix進行qPCR。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以β-actin作為內參照，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。詳細引物序列見表1。

表1 RT-qPCR中所用的引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.5 質粒轉染 應用Lipofectamine 3000和P3000試劑，pCMV3或空pCMV3載體轉染HK-2細胞。將HK-2細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔板中，質粒及轉染試劑加至無血清、無抗生素培養基中，孵育6 h后，將培養基改為含抗生素和10%胎牛血清的新鮮DMEM培養基繼續孵育6 h。

4 統計學處理

計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，數據來自至少3次獨立實驗，各組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1 過表達Sirt3可減輕高糖刺激誘導的HK-2細胞衰老

1.1 高糖對HK-2細胞Sirt3表達的影響及高糖刺激誘導細胞衰老過程 Western blot及RT-qPCR結果顯示，與NG組比較，在高糖刺激48 h后，HK-2細胞中Sirt3蛋白及mRNA表達顯著降低（P<0.05）。高糖環境下HO-1的表達隨刺激時間的延長而變化，呈先上升后下降的趨勢（P<0.05）。P16和P21蛋白的表達均呈時間依賴性，NG組中P16蛋白表達很少，P21幾乎不表達。與NG組相比，在高糖培養48 h后，HK-2細胞中P16和P21蛋白的表達顯著增加（P<0.05），且可觀察到更多的SA-β-Gal陽性細胞，見圖1。

Figure 1. High glucose decreased the expression of the Sirt3 protein， induced oxidative stress， and accelerated cellular senescence in HK-2 cells. A： HK-2 cells were treated with HG （30 mmol/L） for different time periods. The protein levels of Sirt3， P16，P21 and HO-1 were analyzed by Western blot； B： Sirt3 mRNA expression under the different conditions was examined by RT-qPCR； C： image of SA-β-Gal staining in the NG and HG groups treated for 48 h， as captured by microscope， blue staining reflects positive cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NG group.圖1 高糖可降低HK-2細胞中Sirt3蛋白的表達，誘導氧化應激，加速細胞衰老

1.2 探索過表達Sirt3能否使HK-2細胞對抗高糖刺激誘導的細胞衰老 如圖2A，Western blot結果顯示，與NG組相比，高糖刺激48 h后HO-1蛋白的表達明顯減低，P16和P21蛋白的水平顯著升高（P<0.05）。與HG+vector組比較，過表達Sirt3后P16和P21蛋白的表達水平均明顯降低（P<0.05），且過表達Sirt3可顯著逆轉高糖環境下細胞內ROS的積聚（圖2B）。與HG組相比，HG+Sirt3組SA-β-Gal陽性細胞較少（圖2C）。

Figure 2. Overexpression of Sirt3 protects against HG-induced oxidative stress and cellular senescence. A： the protein levels of HO-1， P16 and P21 were analyzed by Western blot； B： intracellular ROS accumulation was detected by a fluorescence microscope； C： stress-induced senescence of HK-2 cells was detected by SA-β-Gal staining， blue staining reflects positive cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group； ##P<0.01 vs HG+vector group.圖2 過表達Sirt3可使HK-2細胞對抗高糖誘導的氧化應激和應激性衰老

2 過表達Sirt3對HK-2細胞中Keap1/Nrf2通路及其下游蛋白NQO1的影響

Western blot結果顯示，在高糖刺激后6 h，Nrf2和NQO1蛋白水平均升高，并持續升高至24 h，在48 h后逐漸下降（P<0.05）。如圖3B所示，與NG組相比，高糖（48 h）環境下HK-2細胞中Nrf2、NQO1蛋白降低，Keap1蛋白表達升高（P<0.05），質粒轉染過表達Sirt3后，Nrf2及其下游蛋白NQO1的表達增加，keap1表達降低（P<0.05）。為了評估Nrf2轉錄的變化，我們檢測了核Nrf2蛋白的表達水平。結果顯示，與HG+vector組相比，在Sirt3轉染的HK-2細胞中，細胞核Nrf2的表達顯著增加（P<0.05），見圖3C。

Figure 3. Effects of Sirt3 overexpression on Keap1/Nrf2 pathway-related proteins in HK-2 cells under high glucose environment. A：the levels of Keap1/Nrf2 signaling pathway related proteins in HK-2 cells detected by Western blot； B： the effect of Sirt3 overexpression on the Keap1/Nrf2 signaling pathway related proteins in HK-2 cells detected by Western blot； C： the effect of Sirt3 overexpression on the nuclear Nrf2 in HK-2 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group； #P<0.05， ##P<0.01 vs HG+vector group.圖3 Sirt3過表達對高糖環境下HK-2細胞中Keap1/Nrf2信號通路相關蛋白的影響

3 抑制Keap1/Nrf2通路的活性可削弱Sirt3對HK-2細胞的作用

為進一步驗證Sirt3是否通過Keap1/Nrf2通路保護HK-2細胞，對抗高糖刺激誘導的細胞衰老，我們采用ML385（Nrf2抑制劑）抑制Keap1/Nrf2通路活性。Western blot結果顯示，與HG+Sirt3組相比，加入ML385后，Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），衰老相關蛋白P16和P21的表達水平顯著升高（P<0.05），見圖4。

Figure 4. Effects of Sirt3 overexpression on Keap1/Nrf2 pathway-related proteins such as Nrf2， NQO1， HO-1 （A）， p16 and p21 （B）in HK-2 cells under a high glucose environment after adding ML385. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group； #P<0.05 vs HG group； △△P<0.01 vs HG+Sirt3 group.圖4 ML385可逆轉過表達Sirt3對高糖環境下HK-2細胞應激性衰老的影響

討論

本研究結果表明高糖可誘導HK-2細胞應激性衰老，過表達Sirt3可減輕高糖誘導的氧化應激，增加抗氧化酶的表達，降低細胞內ROS的集聚，抑制細胞衰老。過表達Sirt3激活Keap1/Nrf2信號通路及其下游蛋白，而特異性抑制Keap1/Nrf2信號通路活性可導致上述作用明顯減弱。提示Sirt3可通過激活Keap1/Nrf2通路及其下游蛋白的表達，在抗氧化應激和高糖應激誘導的衰老中發揮作用。

既往研究表明，在DN早期，腎小管上皮細胞即表現出應激性衰老和腎小管功能障礙，這可能是各種病理損傷的重要原因［11］。動物實驗中，在早期糖尿病大鼠模型發現衰老的腎小管上皮細胞。建模10天后，衰老相關蛋白P16、P21和SA-β-Gal的表達顯著增加［12］。在體外，高糖環境下腎小管上皮細胞亦出現應激誘導的衰老［13］。本研究結果表明，在高糖刺激的腎小管上皮細胞中，P16和P21蛋白的表達呈時間依賴性，于高糖刺激12 h時開始增加，48 h達到峰值，SA-β-Gal陽性細胞數量在48 h顯著增加。

Sirtuins是依賴NAD+的蛋白去乙酰化酶，介導對應激刺激的適應性反應［14］。其中，Sirt3在維持線粒體穩態及功能等方面發揮重要作用，如調節ROS的生成。研究表明，Sirt3介導的線粒體抗氧化應激效應參與apigenin對糖尿病大鼠腎臟的保護作用，且顯著提高細胞內NAD+/NADH比值，繼而減輕高糖環境下近端腎小管上皮細胞損傷［15］。Sirt3具有抗細胞衰老的作用。體外實驗表明，通過激活Sirt3信號可抑制高糖誘導內皮細胞衰老過程［16］。Sirt3對晚期糖基化終末產物誘導的骨髓間充質干細胞衰老和老年性骨質疏松癥有保護作用［17］。本研究結果表明，Sirt3參與高糖刺激誘導的HK-2細胞應激性衰老過程。過表達Sirt3可顯著上調HO-1蛋白的表達，降低細胞內ROS水平。而過表達Sirt3顯著降低了P16和P21蛋白的表達，SA-β-Gal陽性細胞數量顯著減少。這些結果表明，過表達Sirt3可以減輕高糖刺激誘導的氧化應激和應激性衰老。

Keap1/Nrf2通路是體內氧化還原平衡的重要調控途徑。有研究表明，Keap1/Nrf2通路參與糖尿病腎病的發生發展。Nrf2的激活可減輕高糖刺激誘導的氧化應激損傷，抑制腎系膜基質的形成，恢復腎病理損傷［18］。本研究還觀察到高糖條件下HK-2細胞中Nrf2及其下游蛋白NQO1的表達隨刺激時間的變化而變化，呈先增加后下降的趨勢。過表達Sirt3部分逆轉了高糖引起的Nrf2和NQO1蛋白的下調，增加了細胞核Nrf2的表達。結果表明，過表達Sirt3可上調Keap1/Nrf2信號通路的活性，促進Nrf2向細胞核的易位。

近年來，研究發現Nrf2介導的抗氧化通路的破壞是細胞衰老的驅動力［10，19］。另有研究發現，雙氫青蒿素通過Nrf2/HO-1通路降低了骨髓源性抑制細胞（MDSCs）中衰老相關蛋白P16、P21、P53和衰老相關分泌表型的表達［20］。抗氧化劑肉桂醛可以通過激活Nrf2，下調CDKN2A/P16INK4A的表達來抑制角質細胞衰老［21］。本研究采用Nrf2特異性抑制劑ML385進行干預。結果表明，加入ML385后，HK-2細胞中Nrf2及其下游蛋白NQO1的表達顯著下調，而Sirt3對氧化應激和應激性衰老的保護作用消失。以上結果進一步表明，Sirt3通過激活Keap1/Nrf2信號通路，降低高糖刺激誘導的氧化應激反應并對抗應激性衰老的發生。

綜上所述，Sirt3通過上調Keap1/Nrf2通路及其下游蛋白，降低氧化應激反應，減輕高糖環境下應激誘導的細胞衰老（圖5）。Sirt3作為DN治療的潛在靶點，其作用機制仍有待進一步探索。

Figure 5. The possible mechanism by which Sirt3 reduces stress-induced cellular senescence.圖5 Sirt3保護HK-2細胞對抗高糖應激誘導的細胞衰老的可能機制