高效液相色譜-蒸發光散射檢測法測定蒺藜中蒺藜皂苷D的含量

廖明麗,李爭△,高晗,李亞楠,田方,李軍山,2（.神威藥業集團有限公司,河北 石家莊 05430;2.云南神威施普瑞藥業有限公司,云南 楚雄 675099）

蒺藜藥材來源于蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實，味辛、苦，性微溫，有小毒，歸肝經，能平肝解郁，活血祛風，明目，止癢[1]。蒺藜含有甾體皂苷、黃酮、多糖、生物堿、氨基酸等成分，以甾體皂苷為主，也是主要的藥效成分[2-4]。有研究證實蒺藜皂苷治療心血管疾病具有明確療效[5]，此外，還具有降血糖[6]、抗菌、抗腫瘤、性強壯等作用[7]，研究多以蒺藜皂苷元為指標進行考察[8-9]。蒺藜皂苷D屬于蒺藜皂苷，有報道稱蒺藜皂苷D能抑制腫瘤細胞生長并促進其凋亡[10]，還可改善銀屑病皮損處的炎癥反應和免疫反應[11]，關于蒺藜中蒺藜皂苷D的含量測定方法報道較少，有文獻報道過該成分的含量測定方法，但供試品制備方法極為復雜，需先回流提取、再經過大孔樹脂柱進行洗脫[12-13]。本次研究圍繞簡化藥材中蒺藜皂苷D含量測定中供試品的制備方法，建立高效液相色譜-蒸發光散射檢測法（HPLC-ELSD）測定蒺藜中蒺藜皂苷D含量的方法，旨在為更好、更方便地控制蒺藜質量提供可靠的依據。具體報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），Alltech ELSD-6000型蒸發光散射檢測器（美國奧泰科技公司），Sartorius CPA225D型分析天平（德國賽多利斯公司），KH7200DE型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 蒺藜皂苷D對照品（批號：112022-201601），購自中國食品藥品檢定研究院，含量以95.3%計。

蒺藜藥材：采購于內蒙、遼寧、吉林等不同的產地，藥材經原河北省藥品醫療器械檢驗研究院孫寶惠老師鑒定為蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性 采用的色譜柱為InertSustain C18（250×4.6mm，5μm），以乙腈-水（45∶55）為流動相，柱溫為30℃，流速1.0mL/min，使用ELSD-6000型蒸發光散射檢測器，進樣量為20μL。理論板數按蒺藜皂苷D峰計算應不低于3000。

2.2 對照品溶液制備 取蒺藜皂苷D對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1mL含51.5μg的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過三號篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取60%甲醇10mL加入，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

按照以上色譜條件，蒺藜皂苷D與相鄰峰分離度符合要求，見圖1。

圖1 HPLC圖譜。注：A.蒺藜皂苷D對照品；B.供試品

2.4 線性關系考察 精密吸取配制好的濃度為51.5μg/mL的蒺藜皂苷D對照品溶液，分別取4μL、6μL、10μL、15μL、20μL注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積（A）的對數為縱坐標y，進樣質量（m）的對數為橫坐標x，作線性回歸分析，得回歸方程為Ln（A）=0.5395Ln（M）-6.212，r=0.9996，見表1。實驗結果證明，蒺藜皂苷D進樣質量在0.206-1.030μg范圍內呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下的對照品溶液10μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6針，記錄峰面積，見表2。

表2 精密度試驗

2.6 重復性試驗 取同一藥材樣品粉末6份，按“2.3”項下的方法進行供試品溶液制備，按“2.1”項下色譜條件進行測定，見表3，結果證明，本方法的重復性良好。

表3 重復性試驗

2.7 回收率試驗 稱取已知含量的藥材樣品粉末（0.0209%）約0.5g，分別精密稱定6份，置10mL容量瓶中，精密量取濃度為0.103mg/mL蒺藜皂苷D對照品溶液各1mL加入，加60%甲醇適量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，用60%甲醇定容至刻度，濾過，取續濾液，即得。計算加樣回收率，見表4，結果證明本方法回收率良好。

表4 回收率試驗

2.8 穩定性試驗 精密吸取供試品的溶液20μL，每五個小時進樣一次，共五次，記錄峰面積，見表5，由結果可知，供試品溶液中蒺藜皂苷D在20小時內穩定。

表5 穩定性試驗

2.9 藥材含量測定 精密稱取6批藥材樣品，各平行2份，按“2.3供試品溶液制備”項下的方法進行供試品溶液制備，進樣量為20μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算含量測定結果，見表6。

表6 各產地藥材含量測定結果

3 討論

文獻已報道的蒺藜藥材中的蒺藜皂苷D含量測定供試品的制備方法，操作較繁瑣，難重現。本實驗藥材供試品的制備方法為使用60%甲醇溶液，進行超聲處理30分鐘，提取效果最佳，處理過程簡單，使準確度增加，大大節省了供試品的制備時間，節約了成本，降低了能耗。

從6份不同樣品的蒺藜藥材中蒺藜皂苷的含量測定結果看，各產地差異較大，遼寧產地優于其他兩個產地，推測與產地相關，還有可能與藥材性狀、采收、產地加工等相關[14]，藥材樣品中有顏色深淺的區別，遼寧產地藥材性狀明顯優于其他產地。

有報道測定蒺藜皂苷的含量多采用蒸發光散射檢測器[15]，蒺藜皂苷D無紫外吸收，故本研究采用了蒸發光散射檢測器，對蒺藜皂苷D有通用響應，建立了蒺藜皂苷D的含量測定方法。HPLCELSD法準確、簡便、靈敏，精密度、重復性、回收率及線性關系良好，可適用于蒺藜藥材中蒺藜皂苷D的含量測定。