基于16S rDNA 高通量測序技術分析不同身體質量指數兒童的腸道菌群結構差異

安靜 郭會敏 孔蕊

隨著社會經濟的快速發展，人們生活水平的提高以及膳食結構也發生轉變，近年來，我國居民肥胖人群明顯增加，且兒童肥胖率的上升速度高于成年人，其中我國6 歲以下兒童超重率達到6.8%和肥胖率達3.6%［1-2］。肥胖本身是一種疾病，也是發生高血壓、高血脂、胰島素抵抗、糖尿病等多種慢性疾病的危險因素，其發生受遺傳、環境、個體等多種因素的影響［3］。腸道菌群是在人體消化道的重要組成成分。目前有研究表示［4］，人體內的腸道微生物環境與脂肪、碳水化合物及氨基酸等物質的代謝息息相關，腸道菌群和肥胖癥之間存在著一定的相關性。身體質量指數（body mass index，BMI）是目前臨床評估和診斷肥胖最常用的指標，以體重和身高的比值進行計算，可間接反映人體脂肪成分的數量［5-6］。有研究報道表示［7］，BMI 與人糞便微生物群組成具有顯著的相關性。為進一步探尋肥胖、不同身體質量指數與和腸道菌群結構的關聯性，本研究基于16S rDNA 高通量測序技術分析不同身體質量指數兒童的腸道菌群結構差異，對肥胖進行分層和鑒別，分辨菌群結構不同與身體質量指數類型的聚類關系，為臨床肥胖兒童針對性治療和干預提供理論指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020 年8 月至2022 年8 月82 例到許昌市中心醫院進行健康體檢的兒童作為研究對象，納入標準：①年齡6～14 歲的兒童；②符合超重或單純性肥胖的診斷標準［8］；③兩個月內未使用抗生素、益生菌及其他腸道藥物的兒童；④留取大便樣本前2 周內無應激創傷、嚴重感染、便秘或腹泄等癥狀的兒童；⑤所有受試兒童其監護人均簽署知情同意書。排除標準：①有先天性遺傳代謝疾病、I 型糖尿病等基礎疾病導致的代謝紊亂及中樞神經系統疾病的兒童；②有腎臟疾病或血管因素導致的高血壓等的兒童；③患有其他重大疾病且無法進行相關檢查的兒童。由本院醫護人員統一對體檢兒童的身高和體重進行測量，按照國際通用的BMI 計算方法對其身體質量指數進行計算［9］，即BMI=體重（kg）/身高（m）2。其中BMI 18.5～＜24 為正常組，BMI≥24 為肥胖組，根據其身體質量指數（BMI）分為正常組及肥胖組，正常組兒童50 名，其中男童28 名，女童22 名，平均年齡（8.03±3.78）歲；平均BMI（20.39±1.53）kg/m2。肥胖組32 例，男童19例，女童13 例，平均年齡（7.54±3.19）歲；平均BMI（26.69±1.53）kg/m2。兩組患者的年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已經醫院醫學研究倫理委員會審批同意。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

采用問卷調查的方式對受試兒童的性別、年齡等資料進行收集，并現場對受試兒童的身高、體重及BMI 進行記錄。

1.2.2 樣本收集與儲存

所有受試兒童均留取早晨新鮮糞便于無菌干燥采便盒內，并裝入2 mL 試管，于液氮中儲存，于4℃條件下冷藏，并在采集4h 內送到實驗室-80℃冰箱處保存。

1.2.3 DNA 提取、PCR 擴增及測序

取適量樣本至離心管中，使用無菌水將樣本稀釋至1 ng/μL，采用QIAamp DNA stool Mini kit 試劑盒提取總DNA。使用引物338 F5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3′ 和806 R 5 -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 對16S rDNA（16S ribosomal RNA gene）的基因的V4-V5 區進行后PCR 擴增制備測序文庫進行高通量測序分析。每個樣品DNA 均加上8 bp 的標簽序列，重復擴增3 次。反應程序：95℃預變性2 min；然后進行25 個循環變性包括（95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，30 s）；最后72℃充分延伸5 min。反應體系包括4 μL 的5 X FastPfu Buffer，2 μL 的2.5 mM dNTPs，引物（5 μM）各0.8 pL，0.4 μL 的FastPfu Polymerase 和10 ng 模板DNA，補雙蒸水至20 μL；然后進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在凝膠DNA 片段回收后，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 進行純化，再QuantiFluorTM-ST 進行定量，然后在Illumina MiSeq 高通量測序平臺進行測序。

1.2.4 數據分析

在測序原始數據下機后，首先對測序結果進行質控，然后通過對序列進行拼接、過濾和去嵌合體完成序列優化，最后進行OTU（operational taxonomic units）聚類。各個分類水平上進行群落結構的統計分析。采用Alpha 多樣性分析正常組和肥胖組兒童微生物群落的豐度和多樣性。

1.3 統計學方法

使用Qiime 軟件對腸道菌群的豐富度和多樣性進行分析，計算Ace、Chaol、Shannon、Simpson 指數。采用統計學軟件SPSS 22.0 對數據進行處理。計量資料采用（）表示，行t檢驗；計數資料采用n（%）表示，行χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同身體質量指數兒童的腸道菌群組多樣性指標分析比較

肥胖組的Ace 指數和Chaol 指數明顯低于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；肥胖組的Shannon 和Simpson 指數較正常組低，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同身體質量指數兒童的腸道菌群組多樣性指標分析比較（）Table 1 Analysis and comparison of diversity indexes of intestinal flora in children with different body mass index（）

表1 不同身體質量指數兒童的腸道菌群組多樣性指標分析比較（）Table 1 Analysis and comparison of diversity indexes of intestinal flora in children with different body mass index（）

2.1 不同身體質量指數兒童的腸道菌群結構比較

兒童腸道微生物群落在門水平上排名的分別為：厚壁菌門＞擬桿菌門＞放線菌門＞變形菌門。肥胖組的變形菌門水平明顯高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；但兩組的擬桿菌門、擬桿菌屬、乳桿菌屬、志賀菌屬、放線菌門、雙歧桿菌屬水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

圖1 不同身體質量指數兒童的腸道菌群結構分布特征比較Fig. 1 Comparison of structural distribution characteristics of intestinal flora in children with different body mass index

表2 不同身體質量指數兒童的腸道菌群結構比較（）Table 2 Comparison of intestinal flora structure of children with different body mass index（）

表2 不同身體質量指數兒童的腸道菌群結構比較（）Table 2 Comparison of intestinal flora structure of children with different body mass index（）

3 討論

人體腸道菌群被稱為“人類的第二基因庫”［10］，腸道內定植超過1 000 種細菌，編碼的基因數量是人類基因組的150 倍以上，且腸道菌群的種類、數量、結構與多種疾病相關。隨著基因測序技術的發展，腸道菌群在人類疾病中的作用也逐漸被重視。腸道微生物群作為一個重要的“器官”，腸道菌群構成情況與宿主的機體的狀態相關［11］，本研究通過16S rRNA 高通量測序分析不同BMI兒童的腸道菌群差異，篩選出標志菌群，可幫助揭示腸道菌群在肥胖、代謝綜合征等疾病發生發展中作用和機制，為肥胖的治療提供新指標和臨床依據，最終實現臨床輔助診斷及早篩。

本研究結果顯示，肥胖組的Ace 指數和Chaol指數明顯低于正常組，但肥胖組的Shannon 和Simpson 指數雖較正常組低，但兩組的差異無統計學意義。Ace 指數和Chaol 指數均為評估群落豐富度的指標，而Shannon 指數和Simpson 指數是評估腸道微生物菌落多樣性的指標；指數值分別與群落的豐富度和多樣性呈正比的關系［12］。人體腸道菌群種類復雜，但大約有30～40 種占人體腸道菌群的90%，厚壁菌門和擬桿菌門為主要菌群，放線菌門和變形菌門次之［13-14］。厚壁菌門包含有乳桿菌屬、胃球菌屬等，其可將食物纖維分解成短鏈脂肪酸從而促進人體對食物的吸收從而增加能量的攝入，而擬桿菌等也可產生糖苷水解酶，將食物分解為單糖或短鏈脂肪酸，從而幫助人體對食物的分解與吸收［15］。本研究結果顯示，肥胖組兒童的菌群的豐富度雖低于正常組，但兩組兒童的菌群的多樣性沒有太大差異，可能是由于兒童腸道內菌群的組成大致相同，但不同的飲食習慣或其他因素導致兩組兒童的菌群豐富度不同［16］。除此之外還有梭桿菌門、疣微菌門等重要菌群參與著人體腸黏膜上皮細胞的分化與增殖，共同維持著人體腸道免疫系統的穩定，但當人體的腸道菌群結構和組成失衡，或某類細菌數量出現變化時，則可能引發疾病的發生［17］。臧曉明等［18］也在研究中表示，不同BMI 人群的腸道菌群豐度及結構組成有明顯差異，腸道菌群組成結構的不同和菌群豐度的差異可能是導致兒童BMI 變化的重要原因。

在本研究中，不同BMI 兒童的腸道菌群結構存在著差異，兒童腸道微生物群落在門水平上排名的分別為：厚壁菌門＞擬桿菌門＞放線菌門＞變形菌門，其中肥胖組的變形菌門明顯高于正常組，但厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門比較無明顯差異。Chen 等［19］的研究表明，肥胖鼠中的變形菌門存在豐富度提高的現象；李靜等［20］也在研究中表示，肥胖兒童腸道菌群中有出現變形菌門菌群水平升高的情況，且變形菌門水平與BMI 水平存在一定的相關關系。這說明變形菌門水平升高可能與兒童肥胖的發生相關，變形菌門可能是BMI 升高的標志菌群。

綜上所述，不同身體質量指數兒童的腸道菌群的豐度不同，肥胖兒童的腸道菌群的豐度明顯較低，且腸道菌群結構組成有差異，變形菌門可能是BMI 升高的標志菌群，可能在兒童BMI 升高中發揮著重要作用。但由于本研究為單中心研究，且樣本量較少，可能存在一定的地域限制。