扁蒴藤素調節cGAS/STING信號通路對缺血性腦卒中大鼠認知功能和神經炎癥的影響

林曉燕, 方麗鑫, 黃麗霞, 楊杰書

(青島大學附屬青島市中心醫院康復醫學科, 山東 青島 266013)

缺血性腦卒中是一種腦部缺血引起的疾病,嚴重者會導致患者喪失行動和認知能力,具有高發病率、高殘疾率及高死亡率的特點,嚴重增加患者家庭以及社會負擔[1]。近年來,隨著缺血性腦卒中患者的逐漸年輕化,尋求治療缺血性腦卒中的新藥迫在眉睫。缺血性腦卒中可引起一系列的炎癥反應,腦組織中炎癥因子的過度表達會導致患者神經元損傷,進而表現為認知障礙[2]。環磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶/干擾素基因刺激因子(cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes,cGAS/STING)通路的激活可誘導促炎因子過度表達,抑制cGAS/STING信號通路可緩解炎癥反應[3]。扁蒴藤素(Pristimerin,PT)是從衛矛科和翅子藤科植物中提取的一種天然醌甲基三萜,已被證明具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[4],據報道,扁蒴藤素可抑制膿毒癥腦損傷小鼠的神經元炎癥并保護認知功能[5],扁蒴藤素能否通過cGAS/STING通路參與缺血性腦卒中大鼠的認知功能和神經炎癥反應尚未見報道。本研究旨在探索扁蒴藤素對缺血性腦卒中大鼠的認知功能和神經炎癥的影響及其作用機制,為缺血性腦卒中患者的治療提供一定的解決思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物:7～8周齡雄性SD大鼠,SPF級,體質量(200～220)g,購于廣州賽業百沐生物科技有限公司,許可證號:SCXK(粵)2020-0055。大鼠在適宜溫度、相對濕度55%、12h循環光照、可以自由地取食和喝水條件下,喂養7d后用于實驗。

1.2主要試劑:扁蒴藤素(純度:≥98%,規格:20mg/支,編號:DA0040)購于成都德思特生物技術有限公司;線栓,購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司;DMXAA,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;IL-6(SEKR-0005)、IL-1β(SEKR-0002)酶聯免疫試劑盒及cGAS(K006370P),購于北京索萊寶科技有限公司;STING(50494),購于賽信通(上海)生物試劑有限公司;iNOS(sc7271)、Arg-1(sc271430),購于圣克魯斯生物技術有限公司。

1.3方 法

1.3.1造模及分組處理:將大鼠隨機分為Control組(正常大鼠),MCAO組(大腦中動脈栓塞大鼠),扁蒴藤素低、中、高劑量組(PT-L組、PT-M組、PT-H組)、扁蒴藤素高劑量+DMXAA組(PT-H+DMXAA組),每組15只。除Control組外,其余大鼠采用線栓法[6]制備MCAO模型,暴露大鼠頸總動脈,插入線栓并固定阻斷大腦中動脈一定時間后恢復,縫合傷口,Control組大鼠僅做暴露頸動脈及縫合處理。根據大鼠神經功能缺陷評分法評價造模是否成功(1～3分視為造模成功)。造模成功后,大鼠在適宜環境下自由進食飲水24h后,PT-L組、PT-M組、PT-H組分別采用灌胃的方式給予10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg扁蒴藤素[5],PT-H+DMXAA組灌胃100mg/kg扁蒴藤素+25mg/kgDMXAA[7],Control組(正常大鼠),MCAO組給予等量生理鹽水,1次/d,連續給藥7d。實驗過程所有操作均經過本院實驗動物倫理學審核批準。

1.3.2大鼠神經功能行為評價:給藥結束之后,采用Zea-Longa評分評估各組大鼠神經功能。評分規則:0分:無神經功能損傷;1分:提尾時不能完全伸展對側前肢;2分:行走時向對側旋轉;3分:行走時身體向對側傾倒;4分:無法行走,意識喪失。

1.3.3大鼠認知功能評價:通過Morris水迷宮實驗對大鼠的認知功能進行評價,將水池均分為4個板塊,其中一個板塊中放入隱藏平臺。定位航行實驗:在池壁任意一起點放入大鼠,記錄大鼠的游泳路徑及找到目標平臺的時間(潛伏期),若90s找不到平臺,則潛伏期記為90s。在固定時間訓練4次/d,每次間隔90s,計算潛伏期平均值,訓練連續進行4d;空間探索實驗:移走站臺,在任一入水點放入大鼠,記錄大鼠在90s內的游泳路徑及在原平臺位置穿越的次數,評價大鼠的空間定位能力。

1.3.4腦組織病理學變化觀察:HE染色法觀察各組大鼠腦組織病理學變化,每組隨機取5只大鼠,脫頸處死大鼠,取部分腦組織經固定(10%福爾馬林溶液)、脫水、包埋、切片、干燥、蘇木精-伊紅染色,在顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3.5大鼠腦梗死面積計算:2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法觀察并計算大鼠腦梗死面積。各組隨機選取5只大鼠脫頸處死后迅速取腦,液氮速凍后進行冠狀切片,每只5片,放入2%TTC溶液中染色,37℃水浴處理15min,固定,拍照并使用Image軟件計算腦梗死面積。

1.3.6大鼠血清中各因子水平檢測:ELISA法檢測大鼠血清中IL-6、IL-1β水平。對各組剩余5只大鼠進行腹腔靜脈采血,離心,取上清液,按照ELISA試劑盒說明檢測大鼠血清中IL-6、IL-1β水平。

1.3.7大鼠腦組織中iNOS、Arg-1、cGAS、STING蛋白表達水平:1.3.6中大鼠脫頸處死,取腦組織,加入RIPA裂解液、離心提取總蛋白并進行定量分析;經凝膠電泳、轉膜,加入5%脫脂奶粉封閉90min,TBST清洗3次,加入一抗稀釋液,在4℃條件下孵育過夜;次日加入對應二抗孵育,在室溫條件下繼續孵育120min,TBST清洗3次,曝光顯影,分析蛋白表達。

2 結 果

2.1各組大鼠神經功能評分比較:與Control組比較,MCAO組大鼠神經功能評分顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組大鼠神經功能評分呈劑量依賴性降低(P<0.05);與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠神經功能評分顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分比較

2.2各組大鼠認知功能比較:與Control組比較,MCAO組大鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.05),穿過原平臺位置的次數顯著減少;與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組大鼠逃避潛伏期縮短,穿過原平臺位置的次數顯著增多(P<0.05),且呈藥物劑量依賴性。與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠逃避潛伏期顯著延長,穿過原平臺位置的次數顯著減少(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期及穿過平臺次數比較

2.3各組大鼠腦組織病理學比較:Control組大鼠腦組織海馬CA1區,細胞染色均勻,細胞形態正常,排列規則緊密;MCAO組腦組織海馬CA1區神經元細胞較多病變壞死,細胞核萎縮染色不均勻,細胞排列紊亂;與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組細胞形態改善,神經元增多;與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組細胞變形、神經元壞死嚴重,見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織海馬CA1區病理學變化(HE染色,×400)

2.4各組大鼠腦梗死面積比較:圖片中白色區域即為腦梗死部分,與Control組比較,MCAO組大鼠腦組織切片中,白色區域擴大,即腦梗死面積顯著增加(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組切片中變色區域逐漸縮小,即大鼠腦梗死面積減少(P<0.05),且呈劑量依賴性;與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠腦梗死面積顯著增加(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腦組織TTC染色

表3 各組大鼠腦梗死面積比較

2.5各組大鼠小膠質細胞iNOS和Arg-1表達比較:與Control組比較,MCAO組iNOS表達顯著升高,Arg-1表達顯著降低(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組iNOS表達顯著降低,Arg-1表達顯著升高(P<0.05);與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組iNOS表達顯著升高,Arg-1表達顯著降低(P<0.05),見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腦組織iNOS和Arg-1表達比較

表4 各組大鼠小膠質細胞iNOS和Arg-1表達比較

2.6各組大鼠血清中IL-6、IL-1β水平比較:與Control組比較,MCAO組大鼠血清中IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組大鼠血清中IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05);與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠血清中IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠血清中IL-6 IL-1β水平比較

2.7各組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達:與Control組比較,MCAO組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達顯著降低(P<0.05);與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達顯著升高(P<0.05),見圖4、表6。

圖4 各組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達

表6 各組大鼠腦組織中cGAS STING蛋白表達比較

3 討 論

缺血性腦卒中又被稱為腦梗、中風,由腦部供血障礙引起部分腦組織缺血而導致,已成為我國發病率較高的疾病之一,由于發病速度快,就診時即已出現認知損傷及神經炎癥,因此,在損傷初期進行一定藥物干預對患者預后具有重要意義。

中樞神經炎癥在缺血性腦卒中導致的認知功能障礙中發揮關鍵作用,降低缺血性腦卒中后的炎癥反應是目前臨床上緩解缺血性腦卒中后遺癥的主要手段之一[8]。扁蒴藤素屬于醌甲基三萜類化合物,是中藥過山楓的重要活性成分,具有顯著的抗炎活性,可抑制促炎因子(如腫瘤壞死因子、IL-6等)分泌,提高抑炎因子(如IL-10)分泌,已被證明可降低腦損傷小鼠的神經元炎癥反應,保護其認知功能[5]。本研究結果顯示,扁蒴藤素可改善腦卒中大鼠的認知功能障礙,縮小腦組織梗死面積,緩解炎癥損傷。小膠質細胞是中樞神經系統中的一種免疫細胞,參與神經炎癥的發生、發展過程,在腦卒中后的病理發展中具有重要調控作用。非活化狀態的小膠質細胞在不同的環境下可被刺激極化為M1型(標記物iNOS)或M2標記物(Arg-1)型,M1型小膠質細胞可釋促炎因子,加重炎癥細胞浸潤,破壞神經元,加重神經功能損傷;M2型小膠質細胞可釋放抗炎因子,抑制炎癥反應,緩解神經功能損傷。有研究證明,抑制小膠質細胞M1型極化可縮小缺血性腦卒中大鼠腦梗死面積,減少神經元細胞凋亡,緩解炎癥反應[9]。表明抑制小膠質細胞M1型活化是治療腦卒中神經炎癥損傷的有效方法。在本研究中,PT干預后,缺血性腦卒中大鼠腦組織中iNOS表達下調,Arg-1表達上調,且促炎因子IL-6、IL-1β水平降低,表明扁蒴藤素可抑制缺血性腦卒中大鼠腦組織小膠質細胞M1型活化,促進小膠質細胞的M2型活化,緩解神經元損傷。

cGAS/STING信號通路參與炎癥、癌癥、神經元損傷的發展,據報道,小膠質細胞cGAS/STING通路可被線粒體DNA激活,促進促炎微環境的形成,加重缺血再灌注誘導的神經炎癥和腦損傷,抑制cGAS/STING通路的激活是治療缺血性腦卒中的新治療途徑[10]。此外,有研究顯示,脂多糖(LPS)誘導的小膠質細胞M1極化伴有cGAS/STING通路激活,cGAS拮抗劑和STING拮抗劑可抑制LPS誘導的小膠質細胞M1極化;表明cGAS/STING信號通路的激活與小膠質細胞向M1表型激活相關。cGAS是一種核苷酸轉移酶,存在于多種組織細胞中,當機體出現細胞損傷或應激反應后,cGAS和STING表達上調,促進炎癥因子的釋放,導致細胞凋亡率升高,加重機體組織損傷[10]。申明琪[11]等研究發現抑制cGAS/STING通路可降低缺血缺氧性腦病新生大鼠腦缺血后神經細胞的凋亡,減輕腦組織損傷。劉凱[12]等研究發現,抑制cGAS/STING通路對腦缺血/再灌注損傷大鼠具有一定的腦保護作用。在本研究中,扁蒴藤素干預可以抑制cGAS、STING蛋白的表達,下調IL-6、IL-1β水平,進而緩解大鼠的腦組織病理發展,與上述文獻研究結果一致。提示扁蒴藤素可能通過抑制cGAS/STING通路,抑制小膠質細胞向M1表型激活,進而緩解腦卒中大鼠認知障礙及神經炎癥損傷。

綜上所述,扁蒴藤素可通過抑制cGAS/STING通路緩解腦卒中大鼠認知障礙及神經炎癥損傷,其具體作用機制還需進一步探究。