卡瑞利珠單抗聯合化療藥物熱灌注對原發性肝癌PD-1/PD-L1信號通路的影響

姜 磊, 劉 成, 孫萬亮, 周 凱, 王 超, 李 陽

(蚌埠醫學院第一附屬醫院, 安徽 蚌埠 233400)

原發性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC)是我國常見的癌癥之一,好發于肝細胞或肝內膽管細胞,具有發病率高、預后差等特點。全球數據統計顯示[1],PHC發病率在惡性腫瘤中位居第6,死亡率位居第3。早期的PHC癥狀較不明顯,大多數患者在被確診時,已經到達了中晚期,通常會錯過最佳手術時機,因此臨床上主要通過介入治療、放化療等方式控制疾病進展,盡可能延長患者的生存期。化療藥物熱灌注治療是將肝動脈化療栓塞(transarterial chemoembolization,TACE)結合熱療,一起殺死腫瘤細胞的治療方法,是目前臨床常用于治療PHC的一種方法[2]。然而化療藥物熱灌注可導致腫瘤微血管增生、建立側肢循環而減弱療效,有學者認為,聯合使用化療藥物熱灌注和免疫藥物,在治療中晚期PHC患者中可能是最理想的方法之一[3]。近年來隨著免疫檢查點分子(immune checkpoint molecular,ICM)的廣泛使用,為臨床免疫治療PHC提供了新的思路。研究發現,ICM在腫瘤細胞中表達升高,其會通過激活T細胞免疫負調控通路使癌細胞逃避被宿主免疫系統攻擊[4]。程序性死亡受體1(programmed death-1,PD-1)是T細胞表達的重要ICM之一,可通過調節多種生物學作用發揮免疫負調控作用,如抑制T細胞增殖、活化及殺傷功能、降低促炎性細胞因子產生等。卡瑞利珠單抗是我國第一個被批準用于治療晚期肝癌的一種PD-1抑制劑,其可通過阻斷PD-1通路影響免疫抑制反應,進而發揮抗腫瘤作用[5]。隨著免疫藥物研究的進展,化療藥物和熱灌注聯合免疫治療被廣泛應用于PHC的治療中,并成為了一種新的治療趨勢。因此,本研究分析了卡瑞利珠單抗與化療藥物熱灌注聯合治療PHC的效果,旨在為疾病治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料:于2019年2月至2021年3月,選取我院收治的中晚期PHC患者80例,其中男性47例,女性33例,本研究經我院倫理審批委員會審核批準(倫科批字[2018]第123號)。采用隨機數字表法將80例患者分為化療藥物熱灌注組和卡瑞利珠單抗聯合組,每組40例。化療藥物熱灌注組中男23例,女性17例,年齡43～78歲,平均年齡(60.1±5.2)歲;病程1～2年,平均病程(1.48±0.31)年;巴塞羅那(BCLC)分期中B期27例,C期13例;Child-Pugh分級中A級28例,B級12例;ECOG評分中0分10例,1分25例,2分5例;腫瘤大小(4.26±1.07)cm;腫瘤個數(1.95±0.36)個。卡瑞利珠單抗聯合組中男25例,女性15例,年齡41～75歲,平均年齡(61.4±4.8)歲;病程1～2年,平均病程(1.41±0.26)年;巴塞羅那(BCLC)分期中B期24例,C期16例;Child-Pugh分級中A級30例,B級10例;ECOG評分中0分12例,1分20例,2分8例;腫瘤大小(4.35±1.10)cm;腫瘤個數(1.89±0.31)個。兩組患者性別、病程、年齡、BCLC分期、ECOG評分、Child-Pugh分級等一般資料比較無顯著差異(P>0.05)。

1.2診斷標準:西醫診斷肝癌的標準是要求患者在彩超、增強CT、MRI或選擇性肝動脈造影等影像學檢查中表現出兩種典型的肝癌特征,并且經過AFP檢測證實疾病屬于中晚期原發性肝癌。

1.3納入標準和排除標準

1.3.1納入標準:①經病理學、影像學和血清學診斷為PHC;②肝臟儲備功能量化評估分級標準Child-Pugh分級為A、B級;③肝癌臨床分期符合BCLC分期,為B期或C期;④患者體力和活動狀態符合ECOG評分<3分;⑤預計生存期>3個月;⑥出院后進行定期隨訪的患者;⑦可以耐受卡瑞利珠單抗治療者;⑧患者的臨床資料和實驗室檢測結果完整;⑨未接受相關免疫藥物治療者。

1.3.2排除標準:①同時患有其它原發性腫瘤或自身免疫性肝病者;②同時患有嚴重感染患者;③合并心、腦血管、造血系統疾病者;④伴有活動性結核、精神疾病患者;⑤妊娠或哺乳期婦女;⑥有嚴重的危害患者安全或影響患者完成研究的伴隨疾病者。

1.4方法:所有患者均采用經典Seldinger法進行股動脈穿刺,留置5F導管鞘并插入5FRH導管直至到達腹腔干,通過肝動脈造影明確患者肝腫瘤數目、大小及血供情況。化療藥物熱灌注組:將750mg/m2氟尿嘧啶和20mg/m2吡柔比星用熱化療灌注機加熱至50℃,再通過加壓的方式,超選擇性將加熱的藥物注入腫瘤區。后將適量的吡柔比星用40%的碘油進行充分乳化,并用于腫瘤供血動脈遠端栓塞,當發現碘油沉積時,再將明膠海綿注入。卡瑞利珠單抗聯合組先經導管加壓灌注采取和化療藥物熱灌注組相同的化療藥物熱灌注方法治療,術后通過靜脈滴注的方式給予200mg/次卡瑞麗珠單抗(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司,國藥準字S20190027),每3w滴注1次,21d為一個療程,共治療3個療程。

1.5觀察指標

1.5.1療效評估:根據實體瘤療效評價標準,對于治療效果的評估有完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病進展(PD)和疾病穩定(SD)四種情況。其中,CR和PR表示治療有效。客觀緩解率(objective response rate,ORR)的計算方式是將CR和PR的病例數除以總病例數。而疾病控制率(disease control rate,DCR)的計算方式是將CR、PR和SD的病例數除以總病例數。

1.5.2血清腫瘤標志物及外周血T淋巴細胞亞群檢測:采用ELISA法檢測血清中癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)、甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein,AFP)和甲胎蛋白異質體(Alpha-Fetoprotein-L3,AFP-L3)水平;采用FACSCalibur型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測外周血T淋巴細胞亞群。

1.5.3實驗室指標:為了評估兩組患者的肝功能情況,將觀察谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)和堿性磷酸酶(ALP)指標的變化情況。

1.5.4外周血PD-1和PD-L1表達比較:取患者外周血5mL,采用EDTA作為抗凝劑,將淋巴細胞分離液緩慢加入樣本中,隨后利用密度梯度離心技術,分離出單核細胞,PBS洗滌2遍后離心;取細胞沉淀,將樣本加入Trizol裂解液裂解,后提取總RNA,并將RNA逆轉錄為cDNA。用PCR儀進行熒光定量PCR反應,擴增PD-1和PD-L1及GADPH,以GADPH為內參計算PD-1和PD-L1表達所占比例。PD-1引物序列:上游引物:5'-GAGCTGGAAGCAAGGACGAC-3',下游引物:5'-GTCCAGCTCCTCATAGGCCA-3'。PD-L1引物序列:上游引物:5'-CTGGACCTGCTTGCGTTAGTGG-3',下游引物:5'-CCCCTGAAGTTGCTGTGCTGAG-3'。內參GADPH引物序列:上游引物:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3',下游引物:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

1.5.5不良反應:觀察兩組患者治療后出現不良反應情況,包括發熱、惡心嘔吐、肝功能異常、白細胞減少、血白蛋白降低、血小板減少等。

1.5.6隨訪:首次治療3～6周時,對兩組患者分別進行隨訪1次。根據查閱病例資料、電話和微信等方式隨訪患者病史、體檢情況、血常規及生化檢驗、腹部CT或MRI增強掃描等情況。直至2022年5月1日停止對所有患者的隨訪。

2 結 果

2.1兩組患者近期療效比較:對比兩組療效顯示,卡瑞利珠單抗聯合組的近期療效明顯優于化療藥物熱灌注組,差異具有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組患者近期療效比較[n=40,(%)]

2.2兩組患者血清腫瘤標志物比較:治療前卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組患者血清中AFP、AFP-L3、CEA水平比較相比無統計學意義(P>0.05);和治療前相比,治療后卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組患者血清中腫瘤標志物AFP、AFP-L3、CEA水平均明顯降低(P<0.05);和化療藥物熱灌注組相比,卡瑞利珠單抗聯合組患者血清中腫瘤標志物AFP、AFP-L3、CEA水平均明顯降低(P<0.05),卡瑞利珠單抗聯合組抑制血清中腫瘤標志物的效果明顯高于化療藥物熱灌注組,見表2。

表2 兩組患者血清AFP AFP-L3 CEA水平比較

2.3兩組患者外周血T淋巴細胞亞群比較:治療前卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組患者外周血T淋巴細胞亞群比較無統計學意義(P>0.05);和治療前相比,治療后卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組患者外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值均明顯增加(P<0.05);和治療后化療藥物熱灌注組相比,卡瑞利珠單抗聯合組患者外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值均明顯增加(P<0.05),見表3。

表3 兩組患者外周血CD4+ CD8+ CD4+/CD8+比值比較

2.4兩組患者肝功能指標比較:治療前卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組患者肝功能指標比較無統計學意義(P>0.05);和治療前相比,治療后卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組患者ALT、AST、TBIL和ALP水平均明顯降低(P<0.05);和治療后化療藥物熱灌注組相比,卡瑞利珠單抗聯合組患者ALT、AST、TBIL和ALP水平均明顯降低(P<0.05),見表4。

表4 兩組患者肝功能指標ALT AST TBIL和ALP比較

2.5兩組患者PD-1和PD-L1 mRNA相對量表達比較:治療前卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組患者外周血PD-1和PD-L1 mRNA相對量表達比較無統計學意義(P>0.05);和治療前相比,治療后卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組患者外周血PD-1和PD-L1 mRNA相對量表達明顯降低(P<0.05);和治療后化療藥物熱灌注組相比,卡瑞利珠單抗聯合組患者外周血PD-1和PD-L1 mRNA相對量表達明顯降低(P<0.05),見表5、圖1。

圖1 外周血PD-1和PD-L1電泳圖

表5 兩組患者外周血PD-1和PD-L1 mRNA相對量表達比較

2.6兩組患者不良反應比較:卡瑞利珠單抗聯合組疼痛發生率明顯低于化療藥物熱灌注組(P<0.05);但卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組惡心嘔吐、肝功能異常、血白蛋白降低和血小板減少的發生率相比無統計學意義(P>0.05),見表6。

表6 兩組患者不良反應比較(n=40,%)

2.7兩組患者生存率比較:截止到隨訪結束,卡瑞利珠單抗聯合組患者失訪2例,生存率為29/38(76.3%),化療藥物熱灌注組患者失訪1例,生存率為18/39(46.2%);生存率結果顯示,卡瑞利珠單抗聯合組患者生存率明顯高于化療藥物熱灌注組(χ2=5.205,P=0.023)(圖2)。

圖2 兩組患者生存曲線

3 討 論

化療藥物熱灌注是治療腫瘤常用的微創介入手術,其可通過將化療藥物直接注入到腫瘤內部,從而提高藥物在腫瘤局部的濃度,同時通過加熱的方式,可以促進藥物的擴散和滲透,加速藥物的吸收和作用。目前,其因術后并發癥少、疼痛相對較少及改善患者身體狀況被廣泛應用。但化療藥物熱灌注雖可使患者生存受益,但病灶完全壞死率較低,為進一步提升治療效果,臨床通常會將化療藥物熱灌注與免疫治療方法聯合使用。

有研究表明,PD-1作為一種負向調控因子在效應T細胞表面廣泛分布,其在持續的炎癥免疫應答中高表達,可通過結合配體影響負性協同刺激信號抑制外周組織中的持續性免疫反應[6]。此外,PD-1也能夠阻止自身組織受到免疫損傷,避免自身免疫反應引發的破壞性作用。PD-L1是PD-1的主要配體,能夠被廣泛地表達在T淋巴細胞、巨噬細胞等多種細胞上,并且其表達可以被炎癥介質或細胞因子上調。PD-L1通過與PD-1結合從而調節免疫應答,參與多種組織的免疫反應調節[7]。由此可見,PD-1/PD-L1信號作為負性免疫調節通路之一,當PD-1/PD-L1信號被激活時,代表免疫功能受到了抑制。卡瑞麗珠單抗具有較高親和力和靶細胞選擇性,作為PD-1阻斷劑,能與PD-1受體相互結合,從而阻斷PD-1/PD-L1通路形成腫瘤免疫治療。現代藥理結果表明,卡瑞麗珠單抗的作用機制是阻斷PD-1通路,從而抑制T淋巴細胞免疫抑制作用,通過促進T淋巴細胞活化恢復機體免疫系統的功能,最終通過對腫瘤細胞的監視和殺滅而發揮抗腫瘤作用[8]。

本研究結果顯示,卡瑞利珠單抗聯合組和化療藥物熱灌注組均可有效抑制PD-1/PD-L1信號通路激活,且卡瑞利珠單抗聯合組ORR、DCR均高于化療藥物熱灌注組,治療后AFP、AFP-L3、CEA水平及肝功能指標ALT、AST、TBIL、ALP水平均低于化療藥物熱灌注組,提示阻斷PD-1/PD-L1信號通路有利于使栓塞的藥物沉積,增強病灶對化療藥物熱灌注治療的應答。因此,采用卡瑞利珠單抗聯合化療藥物熱灌注治療原發性肝癌晚期患者,可以更好的發揮抗腫瘤作用,加速腫瘤應答,增加患者近期療效,改善肝功能。杜尚云等[9]研究證實,TACE和卡瑞利珠單抗聯合治療PHC患者,其近期療效明顯好于單獨使用TACE患者。本研究結果顯示,與僅使用化療藥物熱灌注相比,卡瑞利珠單抗聯合療法可以顯著增加患者的外周血CD4+細胞數量和CD4+/CD8+比值,表明該治療方案可以有效調節肝細胞癌患者外周血T淋巴細胞亞群。文獻顯示,卡瑞利珠單抗可以結合T淋巴細胞表面表達受體,通過發揮T細胞免疫抑制作用而降低腫瘤對機體免疫系統的負荷,從而使機體的抗腫瘤免疫功能提高[10]。本研究發現,兩組患者均存在一定不良反應發生,且卡瑞利珠單抗聯合組的疼痛發生率明顯低于化療藥物熱灌注組,且生存率高于化療藥物熱灌注組,提示卡瑞利珠單抗聯合化療藥物熱灌注可有效降低患者疼痛,且其它副作用在可接受范圍內,同時增加患者生存率。

綜上所述,卡瑞利珠單抗聯合化療藥物熱灌注抑制PD-1/PD-L1信號通路激活T淋巴細胞亞群,提高機體抗腫瘤免疫功能,從而發揮治療HPC及改善預后作用。