Circ_0007841通過miR-338-3p靶向JAG1促進肝癌細胞惡性生物學活性的機制研究

龔一林, 鄭運周, 趙艷微, 張洪雨, 黃 濤

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八〇醫院檢驗科, 河北 石家莊 050082 2.河北省石家莊市鹿泉區中醫院, 河北 石家莊 050000)

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC是許多國家癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。一般來說,HCC患者在早期是呈現無癥狀的,而在晚期被診斷為患有HCC的患者通常被認為是不適合進行手術性治療的[2]。此外,盡管一些符合手術要求的HCC患者在一定程度上可以通過手術治療從而提高生存時間,但據統計其5年總生存率仍無法令人滿意,只有約50%[3]。因此,迫切需要鑒定出新的生物標志物來提高HCC患者的早期診斷率和總生存率。已有研究表明circRNAs參與各種類型癌癥的發展,包括肺癌、乳腺癌和HCC[4]。circRNA具有一種特殊的共價閉環結構,從而賦予了circRNA比線性轉錄物更穩定的特性。近年來,據報道RNA可能從三個不同的水平上調節基因的表達,分別為轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平[5]。期間,聚集于細胞質中的環狀外顯子RNA可能通過競爭性結合miRNA降低其表達,最終導致這些miRNA的靶基因的表達增強[6];而環狀內含子RNA或外顯子-內含子RNA通常出現在細胞核中,這類circRNA通常可以調節轉錄過程[7]。這些研究表明circRNAs可能參與不同的病理過程。越來越多的研究表明,circRNAs在HCC組織中出現差異表達,并通過靶向不同的miRNAs來調節腫瘤細胞的惡性行為,從而對HCC進程產生影響。例如,circSEC62通過沉默miR-625-5p促進SNRPA水平,最終影響HCC微血管的侵襲。由于circ_0007841在多種癌癥中異常表達,可促進非小細胞肺癌、卵巢癌、骨髓瘤等癌癥的進展[8-10],但其在HCC中的作用確鮮有研究。在HCC中探究了circ_0007841是否能影響其惡性行為,以及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養:人源正常肝上皮細胞THLE-3與肝癌細胞系SNU-387均購自American Type Culture Collection(USA),BEL-7405購自National Infrastructure of Cell Line Resource(China),MHCC-97H、Huh7購自Cell Bank of the Type Culture Collection(China)、HCCLM3購自Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences(China)。所有細胞均用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100g/mL鏈霉素(Gibco Carlsbad,CA,USA)的DMEM培養基(Gibco Carlsbad,CA,USA)于37℃和5% CO2條件的恒溫培養箱中培養。將對數生長期的細胞分別接種在6孔板中(2×105細胞/孔),孵育24h后,使用LiPofectamine 2000 (11668-019,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分別將si-NC、si-0007841-1、si-0007841-2、inhibitor-NC、miR-338-3p inhibitor (Shanghai Genechem Co.,Ltd.,Shanghai,China)(siRNA 40～100nM、inhibitor 50nM)分別轉染到細胞中,操作按照說明書進行。轉染48h后進行后續實驗。

1.2qRT-PCR:取待測HCC cells,使用TRIZOL試劑盒(Invitrogen,USA)提取各樣品中的總RNA。取5μL總RNA樣品,用無RNA酶超純水稀釋20倍,讀取其在紫外分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA的濃度和純度,OD260/OD280比值在1.7～2.1之間者,說明純度較高,能夠滿足后續實驗研究需要。在Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (TaKaRa Biotechnology) 進行逆轉錄反應合成cDNA模版,應用SYBR Green Ⅱ (TaKaRa Biotechnology) 進行Real-time quantitative RT-PCR實驗,反應條件為95℃預變性10min,95℃變性10s,60℃ 退火20s,72℃延伸34s,40個循環。采取手動方式將閾值選定在各對數擴增曲線平行上升的最低點,得到各反應管的Ct值(Threshold cycle),數據采用2-ΔΔCt法進行分析,實驗重復3次。U6與GAPDH作為內參,引物序列(生工生物工程上海股份有限公司合成)詳見表1。

表1 qRT-PCR中使用的引物序列

1.3細胞增殖檢測:使用CCK-8 試劑盒 (Dojindo,Kumamoto,Japan) 檢測細胞的增殖活力。調整細胞濃度為2×103個細胞/孔,接種于96孔板。在不同劑量X射線照射后0、24、48、72h,分別向相應的孔中加入CCK-8試劑。將板37℃再孵育4h,并使用酶標儀測量450nm處的吸光度。

1.4Transwell實驗:DMEM重懸后調整細胞密度為1×106/mL。侵襲實驗時,按1∶8的比例將50mg/L Matrigel膠稀釋后鋪于小室底部;遷移實驗時不鋪膠。24孔板下室加入600μL完全培養基,取各組細胞懸液200μL加入Transwell小室的上室,每組重復3個樣本。24h后取出小室,先用PBS溶液將小室清晰3次,然后用棉簽將小室微孔膜上層的Matrigel膠及細胞輕輕拭凈,接著用多聚甲醛(40g/L,15min)固定,用結晶紫(1g/L,10min)染色,并用PBS溶液清洗,最后將小室置于倒置顯微鏡下進行觀察計數,每個樣本隨機選取6個視野進行計數并求其平均數,以此評估細胞的侵襲、遷移能力。

1.5雙熒光素酶報告實驗:使用Circular RNA Interactome、miRWalk預測分析circ_0007841與miR-338-3p、miR-338-3p和JAG1靶向關系結合位點,通過將結合序列及突變的序列分別克隆至熒光素酶載體pGL3(Pro-mega,Madison,WI,USA)中來建立野生型(circ_0007841/JAG1-WT)和突變型 (circ_0007841/JAG1-MUT)熒光素酶質粒。將構建的質粒分別與miR-338-5p mimic或mimic NC共轉染至Huh7細胞中。24h后,用Dual-Lucy Assay Kit (Solarbio)對熒光素酶活性進行評估。

1.6統計學分析:采用SPSS 21.0 (SPSS,Inc,Chicago,IL,USA) 統計學軟件和GraphPad Prism8.0(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)軟件進行數據分析和作圖,所有數據均采用平均值±標準差的形式表示。兩組間比較采用t檢驗分析,多組之間的比較采用One-Way ANOVA 單因素方差分析,事后檢驗采用Tukey's multiple comparisons test。P為雙側檢驗, P<0.01視為差異極具有統計學顯著性。

2 結 果

2.1HCC中circ_0007841呈高表達且促進其惡性行為:為了探究circ_0007841在HCC中是否具有潛在調控機制,我們利用qRT-PCR檢測了人源HCC細胞系BEL-7405、SNU-387、MHCC-97H、HCCLM3、Huh7中circ_0007841的表達,以正常人源肝上皮細胞系THLE-3為正常對照組,結果觀察到不同HCC細胞系中circ_0007841表達均高于THLE-3,其中Huh7細胞中表達最高(圖1A,均P<0.01),故而我們后續選取Huh7為研究對象,通過si-0007841-1/2敲低Huh7細胞中circ_0007841的表達,qRT-PCR檢測轉染效率si-0007841-1效果更優(圖1B,均P<0.01),后續實驗均使用si-0007841-1作為si-RNA。進一步,我們通過CCK-8、Transwell檢測了細胞的增殖活力、遷移與侵襲能力,觀察到抑制circ_0007841的表達后,HCC增殖活力、遷移與侵襲能力均下降(圖1C、D,均P<0.01)。以上結果提示circ_0007841可能促進HCC的惡性行為。

圖1 circ_0007841促進HCC的惡性行為

購買人源HCC細胞系BEL-7405、SNU-387、MHCC-97H、HCCLM3、Huh7與正常人源肝上皮細胞系THLE-3,A:qRT-PCR檢測HCC細胞系與THLE-3中circ_0007841表達;以Huh7為研究對象,B:qRT-PCR檢測si-0007841-1/2轉染效率;C:CCK-8檢測各組細胞增殖活力;D:Transwell檢測各組細胞遷移、侵襲能力。細胞實驗獨立重復3次,圖中數據均為計量資料,采用均值±標準差的形式表示,數據均采用One-Way ANOVA方差分析,事后檢驗采用Tukey's multiple comparisons test;**表示P<0.01

2.2circ_0007841靶向負調控miR-338-3p:為了探究circ_0007841的潛在調控機制,我們通過circRNA在線數據庫(https://circinteractome.nia.nih.gov/)預測到circ_0007841與miR-338-3p具有結合位點(圖2A),隨即我們通過雙熒光素酶測定進行驗證,結果表明:與共轉染mimics-NC和circ_0007841-WT的Huh7細胞相比,共轉染miR-338-3p mimic和circ_0007841-WT的Huh7細胞熒光素酶活性降低,而用circ_000784-MUT轉染的Huh7中熒光素酶活性沒有顯著變化(圖2B,P<0.01)。最后我們通過qRT-PCR檢測了不同的HCC細胞系以及轉染了si-0007841的Huh7中miR-338-3p的表達,發現miR-338-3p在HCC細胞系中均顯著下調,而轉染si-0007841上調了Huh7中miR-338-3p的表達(圖2C,均P<0.01)。以上提示在HCC中circ_0007841可靶向結合miR-338-3p抑制其表達。

圖2 circ_0007841靶向負調控miR-338-3p

2.3抑制miR-338-3p部分逆轉si-0007841對HCC細胞惡性行為的抑制作用:為了驗證miR-338-3p在circ_0007841影響HCC惡性行為中的作用,我們共轉染了si-0007841與miR-338-3p inhibitor,qRT-PCR檢測到轉染miR-338-3p inhibitor下調了miR-338-3p的表達(圖3A,P<0.01)。而后通過CCK-8與Transwell實驗我們觀察到轉染miR-338-3p inhibitor部分逆轉了由于轉染si-0007841而下調的HCC細胞的增殖活力與遷移、侵襲能力(圖3B、C,均P<0.01)。以上結果提示circ_0007841靶向負調控miR-338-3p發揮促HCC惡性行為作用。

圖3 circ_0007841靶向負調控miR-338-3p促進HCC惡性行為:在轉染了si-0007841的Huh7中轉染miR-338-3p inhibitor,以轉染inhibitor NC為對照,A:qRT-PCR檢測轉染效率;B:CCK-8檢測各組細胞增殖活力;C:Transwell檢測各組細胞遷移、侵襲能力。細胞實驗獨立重復3次,圖中數據均為計量資料,采用均值±標準差的形式表示,數據均采用One-Way ANOVA方差分析,事后檢驗采用Tukey's multiple comparisons test;**表示P<0.01

2.4miR-338-3p靶向負調控JAG1:為了進一步探究circ_0007841影響HCC的下游機制,我們通過miRWalk網站(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預測了miR-338-3p的下游靶向結合基因JAG1(圖4A),同時采用雙熒光素酶報告實驗驗證了miR-338-3p與JAG1的結合關系,共轉染miR-338-3p mimic和JAG1-WT的Huh7細胞熒光素酶活性降低,而用JAG1-MUT轉染的Huh7中熒光素酶活性沒有顯著變化(圖4B,P<0.01)。最后,我們通過qRT-PCR驗證了JAG1在不同HCC細胞以及各組Huh7中的表達,發現在不同HCC中JAG1表達均上調,轉染si-0007841降低了JAG1的表達,而共轉染miR-338-3p inhibitor后則部分逆轉了這種變化(圖4C,均P<0.01)。綜上所述,HCC中高表達circ_0007841可能通過競爭性結合抑制miR-338-3p表達,上調JAG1的轉錄,最終促進HCC的惡性行為。

圖4 miR-338-3p靶向負調控JAG1

3 討 論

越來越多的研究表明circRNA在HCC有差異表達,而這些差異表達的circRNA可能在癌癥診斷和預后中發揮生物標志物的作用[11-12]。然而,HCC中circRNA的相關分子機制仍待進一步探究。因此,我們通過不同HCC細胞系研究了呈上調趨勢的circ_0007841表達對HCC惡性行為的影響和潛在機制。

據報道,大多數circRNAs的功能是作為一種ceRNA來吸收幾個miRNA,然后抑制這些miRNA的活性,這增強了miRNA靶向基因的表達。例如,circTOLLIP可以競爭性結合miR-516a-5p來上調PBX3的表達,從而促進HCC上皮細胞向間質細胞的轉化。在我們的研究中,我們通過熒光素酶活性分析進一步證實了miR-338-3p能夠與circ_0007841結合。此外,我們通過si-RNA與miRNA inhibitor來敲降了circ_0007841與miR-338-3p以觀察HCC細胞的惡性行為變化,發現敲低circ_0007841可抑制HCC的惡性行為,而進一步敲低miR-338-3p的功能挽救實驗則說明circ_0007841是通過miR-338-3p來實現抑制功能的。總的來說,我們的數據初步探究了circ_0007841可以作為miR-338-3p的miRNA海綿,我們的發現可能為circ_0007841在HCC的進展中的circRNA/miRNA調控網絡提供了新的思路。

miRNAs通常通過與靶基因的3'-UTR相互作用來調節靶基因的轉錄。因此,我們通過在線數據庫預測了HCC中 miR-338 -3p的下游潛在靶基因JAG1。JAG1常常在腫瘤細胞中呈高表達,其作為Notch1的配體被認為是腫瘤細胞和腫瘤相關內皮細胞之間的通訊元件,可以增強癌細胞的增殖以及穩定血管。我們通過雙熒光素酶驗證了miR-338-3p與JAG1的靶向關系,利用qRT-PCR檢測了不同HCC細胞系中的JAG1均呈高表達,而抑制circ_0007841后,JAG1表達下調;聯合抑制miR-338-3p的表達后,JAG1表達下調被逆轉。這說明JAG1可能參與了circ_0007841對HCC的影響機制。

綜上所述,我們初步探究了circ_0007841/miR-338-3p/JAG1通路對HCC惡性行為的調控作用,雖然我們并未通過功能挽救實驗驗證下游JAG1的調控作用,但我們認為JAG1作為一個經典的Notch通路相關分子,可能的影響是顯而易見的。我們相信初步解析的circ_0007841在HCC中的調控機制可能為臨床上找尋HCC生物標志物提供新的思路。在未來,我們將進一步多角度、深層次的探究HCC的相關分子調控機制。