EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者血清miR-499 miR-144-3p變化及對預后的預測價值

谷振芳, 徐保彬, 李 偉, 張春梅, 周亞青

(濟寧醫學院附屬醫院, 山東 濟寧 272000)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常見的類型,由于缺乏典型表現,大部分患者就診時已處于晚期,預后較差,Ⅳ期患者5年生存率可低至4%[1]?；熓球寗踊蜿幮?即表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)/間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)野生型晚期NSCLC的主要治療方式,但化療效果有限,晚期NSCLC患者生存時間仍然較短,尋找新的分子靶點,以期為診療及預后預測提供新方向,是近年研究的熱點[2]。微小RNA(microRNA,miR)作為內源性、高度保守的單鏈非編碼RNA,被發現在腫瘤患者中的表達與健康人群存在顯著差異[3]。miR-499被發現具有抑癌作用,在肺癌組織中呈低表達,且能介導放療敏感性,影響患者預后生存率[4]。miR-144-3p也被發現在NSCLC組織中呈低表達,可靶向調控胰島素受體底物1等基因表達,發揮抑癌效應[5]?；诖?本研究分析血清miR-499、miR-144-3p與EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者臨床病理特征及預后的關系展開分析,以期為NSCLC診療提供新方向。

1 資料與方法

1.1一般資料:收集2018年1月至2020年我院收治的107例EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者臨床資料(NSCLC組)。納入標準:經病理學檢查確診為NSCLC(即組織學類型為鱗癌、腺癌、大細胞癌),結合影像學等明確為ⅢB～Ⅳ期(病灶直徑>5cm,且可見淋巴結轉移或遠處轉移);年齡18～80歲;EGFR及ALK均為野生型;影像學檢查、實驗室檢查等資料完整。排除標準:不配合治療或中途停止治療;合并其他腫瘤;入院前接受放化療、靶向治療等抗腫瘤治療;既往肺纖維化、塵肺史;既往臟器移植史;合并免疫缺陷疾病、凝血功能障礙;合并帕金森、癲癇等神經-精神疾病;妊娠期婦女。另取同期健康體檢者107例作為對照組,與NSCLC組性別、年齡1∶1成組匹配,且排除存在腫瘤、放化療史、肺部疾病史、免疫功能缺陷、凝血功能障礙、急慢性感染、神經-精神疾病的健康體檢者。NSCLC組男性88例,女性19例;年齡51～73歲,平均(63.15±5.73)歲。對照組男性85例,女性22例;年齡50～72歲,平均(62.87±5.04)歲。兩組上述基線資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法:NSCLC組收集入院次日清晨空腹外周肘靜脈血3～4mL,對照組收集體檢當日上午空腹外周肘靜脈血3～4mL,3000r/min離心5min獲得血清標本,保存于-80℃冰箱內,取解凍后的血清標本200μL,加入200mL QIAzol裂解液(德國QIAGENE公司),接著使用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒提純得到總RNA,經miScript Reverse Transcription Kit 試劑盒逆轉錄得到cDNA,再采用實時熒光RCR技術(miScriptSYBR Green PCR Kit試劑盒)檢測miR-499、miR-144-3p,以95℃預變性15min,94℃變性15s,55℃退火30s,70℃延伸30s,為PCR擴增程序,共40個循環,55～95℃繪制溶解曲線,計算各反應管循環閾值Ct;以U6為內參,采用2-△△Ct法,計算miR-499、miR-144-3p的相對表達量;上述試劑盒均購自德國QIAGENE公司。

1.3隨訪觀察:所有EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者入院后采用含鉑類的雙藥聯合化療方案,其中吉西他濱+鉑類治療49例(45.79%),培美曲塞+鉑類治療32例(29.91%),紫杉醇+鉑類26例(24.30%)。以NSCLC組出院時為隨訪起點,2023年1月為截止時間,死亡為終點事件。

2 結 果

2.1NSCLC組及對照組血清miR-499、miR-144-3p表達比較:NSCLC組血清miR-499、miR-144-3p相對表達量均低于對照組(P<0.05),見表1。

表1 兩組血清miR-499 miR-144-3p相對表達量

2.2不同臨床病理特征晚期NSCLC患者血清miR-499、miR-144-3p表達比較:晚期NSCLC患者中,Ⅳ期患者血清miR-499、miR-144-3p相對表達量低于ⅢB及ⅢC期者(P<0.05),低分化者則低于中高分化者(P<0.05),見表2。

表2 NSCLC患者血清miR-499 miR-144-3p相對表達量

2.3miR-499、miR-144-3p高表達與低表達者預后生存時間比較:以≥平均值作為高表達的標準,晚期NSCLC患者血清miR-499≥0.74有55例,<0.74有52例;血清miR-144-3p≥0.82有54例,<0.82有53例。晚期NSCLC患者隨訪時間為4～56個月,中位隨訪時間34個月,血清miR-499高表達者預后死亡10例(18.18%),平均生存時間(48.16±2.29)個月,血清miR-499低表達者死亡24例(46.15%),平均生存時間(35.58±2.82)個月,Kaplan-Meier法繪制生存曲線見圖1a,Log Rank法檢驗顯示,血清miR-499高表達者生存率明顯高于低表達者(Log Rank χ2=9.159,P=0.002);血清miR-144-3p高表達者預后生存時間(48.02±2.32)個月,血清miR-144-3p低表達者預后生存時間(35.93±2.79)個月,分別死亡10例(18.52%)、24例(45.28%),生存曲線見圖1b,Log Rank法檢驗顯示,血清miR-144-3p高表達者生存率明顯高于低表達者(Log Rank χ2=8.345,P=0.004)。

圖1 miR-499、miR-144-3p高表達與低表達者預后生存曲線

3 討 論

晚期NSCLC放化療效果不理想,預后差、生存期短,即便是驅動基因陰性的晚期NSCLC,5年生存率也不超過50%[6]。目前,臨床迫切需要新的治療靶點,改善晚期NSCLC患者預后。miR可調控細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移等多種腫瘤生物學行為,目前miR的表達譜主要由腫瘤組織獲得,但晚期惡性腫瘤患者無法手術切除,不適合經腫瘤組織檢測miR表達。然而,miR在外周血中可以微泡形式、與脂類結合形式,或以蛋白復合物的形式存在,故miR在外周血中能持續穩定存在,近年研究也重點分析循環中的miR表達譜,發現miR在多種惡性腫瘤中異常表達[7]。本研究嘗試分析血清miR在EGFR/ALK野生型晚期NSCLC惡性程度與預后生存時間判斷中的應用價值,為晚期NSCLC治療新靶點提供數據支持。

本研究中,NSCLC組血清miR-499相對表達量低于對照組,提示miR-499在晚期NSCLC循環中呈低表達,即miR-499的下調可能參與NSCLC的發生。目前,miR-499被發現在多囊卵巢綜合癥、睡眠呼吸暫停綜合癥等多種慢性疾病中存在異常表達[8]。近年研究顯示,miR-499基因多態性與肝細胞癌、食管鱗狀細胞癌等惡性腫瘤患病風險密切相關。雖然,miR-499異常表達在多種疾病中可見,但其具體作用機制尚未闡明[9]。另外,本研究還發現,Ⅳ期NSCLC患者血清miR-499相對表達量低于ⅢB及ⅢC期者,低分化者則低于中高分化者,提示惡性程度更高、侵襲更廣的NSCLC患者血清miR-499表達更低,miR-499可能與NSCLC的惡性生物學行為密切相關。Li[10]等發現,miR-499可靶向調控癌基因VAV3,介導NSCLC的增殖與轉移,與本文結論相似。Sun[11]等研究發現,miR-144-3p可使Ⅺ型膠原α1基因沉默,參與肺腺癌的侵襲與遷移過程。Fang[12]等通過裸鼠實驗發現,miR-144-3p可通過調控肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)癌基因的表達,影響肺癌組織的生長。上述報道均提示,miR-144-3p可能通過調控原癌基因的表達,參與肺癌的生長及侵襲過程。本研究中,miR-144-3p在晚期NSCLC患者血清中呈低表達,且Ⅳ期及低分化的NSCLC患者血清miR-144-3p相對表達量低于ⅢB、ⅢC期及中高分化者,提示miR-144-3p的低表達可能參與NSCLC的增殖、侵襲、遷移過程,與上述報道結論相似。

NSCLC的預后分子生物學標志物是近年研究的熱點,但目前仍缺乏準確、有效的標志物。本研究對EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者預后生存情況展開分析,發現血清miR-499、miR-144-3p高表達者生存率明顯高于低表達者,提示miR-499、miR-144-3p不僅與NSCLC惡性生物學行為有關,還能預測患者預后。且循環中的miR-499、miR-144-3p檢測簡單易行、有可重復性,在NSCLC預后監測中具有較大前景。

綜上所述,miR-499、miR-144-3p低表達可能與晚期NSCLC的增殖、侵襲、遷移密切相關,且監測血清miR-499、miR-144-3p表達情況對判斷患者預后生存率有利。