基于網絡藥理學與分子對接探討鐵皮石斛抗炎性衰老的作用

石苒羲 ，楊 濤 ，程 慶 ，趙梁辰 ，郭嘉暉 ，王利梅

（1）昆明醫科大學第二臨床醫學院;2）第一臨床醫學院;3）實驗動物學部，云南 昆明 650500）

衰老是生物體不可逆轉的自然進程，隨年齡增長各系統功能出現退行性改變，其中便有免疫功能的退化[1]，使免疫細胞分化、增殖能力下降，出現表型改變和功能缺陷，促炎因子產生增加，血清中炎癥介質水平升高[2-4]。2000 年，Franceschi[5]第一次提出“炎性衰老”的概念，隨著年齡的增長體內各組織發生相關低度炎性反應，被稱為炎性衰老[2，4]。在炎性衰老過程中有兩個重要的炎性因子IL-6 和IL-10[6-7]。IL-6 作為介導急性期炎癥反應的重要細胞因子，是炎癥介質網絡的關鍵成員[7-8]，通過促炎作用對機體造成影響，引起衰老帶來的如老年性癡呆、代謝紊亂、動脈粥樣硬化等年齡相關的健康問題[9]，它的水平對多種疾病的診斷和嚴重程度判斷具有預測價值[8，10]，能作為炎癥感染的嚴重程度、預后判斷及老年人炎性衰老的預測指標[6，11-12]。IL-10 是公認的免疫抑制因子，具有很強的抗炎作用，可以抑制單核巨噬細胞的增殖和活性，使炎癥因子的合成與釋放得到有效抑制[13]，可以阻斷各種炎癥通路[14]，在慢性炎癥的發展過程中能起到一定的延緩作用，對減輕機體的炎癥損傷具有重要意義。老年小鼠對肺炎鏈球菌的先天免疫應答與炎癥加劇中有數據表明，炎癥加劇與IL-10 介導的免疫調節減弱有關，具體表現在IL-10 濃度的降低[15]。

鐵皮石斛是蘭科石斛屬草本植物，有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、增強免疫等藥理作用，能夠有效防止亞健康，有延緩衰老的效果[16-18]。鐵皮石斛是一種有效的免疫調節劑，對免疫功能有增強的作用，能降低TNF-α、IL-6 的產生，抑制巨噬細胞炎癥[19-21]。衰老時體內細胞因子改變使機體處于慢性低度炎性狀態，調節細胞因子、減少炎癥反應可達到抗炎性衰老的目的。石斛具有優越的藥理作用，具有無毒、無致突變、無遺傳毒性的“三無”作用。石斛具有提高免疫、抗衰老的功效，但作用機制尚未被闡明。因此，本研究基于網絡藥理學方法，利用分子對接技術驗證關鍵成分與靶點結合情況，預測石斛抗衰老的潛在機制，通過實驗進一步驗證，為石斛抗衰老的后續研究及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 石斛抗炎性衰老網絡藥理學研究

1.1.1 石斛主要成分檢索及靶點預測利用ETCM 檢索石斛主要成分，通過Pubchem 查詢化合物SMILES 號，用SMILES 號在Swiss TargetPrediction數據庫進行成分靶點的預測，獲得石斛主要成分作用靶點。將成分靶點導入到Cytoscape 中，構建主要成分靶點網絡。

1.1.2 石斛與衰老大鼠作用靶點篩選從Rat Genome Database（https://rgd.mcw.edu/）網站下載SD 衰老大鼠基因。將石斛主要成分作用靶點和衰老大鼠基因進行交集，利用Venny 網站輸入二者信息，得到石斛主要成分作用于衰老大鼠的靶點。

1.1.3 蛋白-蛋白交聯互作網絡構建在STRING數據庫，輸入交集基因，構建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，將結果導入Cytoscape 軟件，根據Degree 值作圖。

1.1.4 靶點GO 和KEGG 富集通路分析利用DAVID 數據庫進行GO 富集分析和KEGG 富集通路分析，得到富集信息。選擇P≤ 0.01 且位靠前列的20 條顯著通路，用富集的名字、GeneRatio、FDR、count 值通過微生信平臺構建富集氣泡圖。

1.2 石斛活性成分-核心靶點分子對接

利用Cytoscape 軟件中Centiscape2.2 對關鍵靶點進行篩選，主要參考 Betweenness、Closeness 和Degree 值選取靶點。利用Cytoscape軟件中cytoNCA 對活性成分進行篩選，degree ＞100，并參考相關文獻。從ZINC 數據庫下載主要藥物活性成分的2D 結構，保存為MOL2 格式，從UniProt 數據庫找到相應蛋白并在AlphaFold Protein Structure Database 網站下載靶點蛋白的3D 結構，保存為PDB 格式，用pymol 對大分子進行前處理。利用Autodock 軟件去水、加氫，對受體和配體進行分子對接，根據對接數值評價其活性，并利用pymol 進行可視化展示。

1.3 石斛抗炎性衰老的動物體內實驗

1.3.1 實驗動物雄性SD 大鼠30 只，20 月齡，體重（300±20）g，購自昆明醫科大學實驗動物學部，使用許可證號SYXK（滇）K2015-0002。經昆明醫科大學實驗動物倫理審查委員會審核批準，倫理審查批準號：KMMU20220834。

1.3.2 實驗試劑及配制鐵皮石斛粉末（含30%石斛多糖），陜西西安百川生物科技有限公司購買，將蒸餾水與石斛粉末按1∶1 配制為溶液，4 ℃冰箱保存。百令膠囊0.5 g/粒，生產廠家杭州中美華東制藥有限公司，1∶20 配制為溶液，4 ℃冰箱保存。IL-6、IL-10 酶聯試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3.3 實驗動物分組和給藥自然衰老SD 雄性大鼠30 只，隨機分為5 組。分別為空白對照組、石斛組（100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）、百令膠囊陽性對照組（40 mg/kg）。空白對照組每天灌胃蒸餾水，每組每天定時灌胃1 次，連續灌胃10 周。

1.3.4 取材及檢測方法心臟取血，血樣離心后取上清液待測。ELISA 測定時每孔加入50 μL 血清和100 μL HRP 酶標記，37 ℃溫育60 min，稀釋洗滌液洗滌5 次并拍干。加入顯色劑A 和顯色劑B，37 ℃避光顯色15 min。最后加入終止液50 μL，以空白組調零，450 nm 波長下依次測量各孔的吸光度。

1.4 統計學處理

網絡藥理數據通過 Genecard、KEGG PATHWAY Database 等數據庫進一步分析。IL-6與IL-10 表達量數據用SPSS 軟件分析，結果用單因素方差檢驗，最小顯著差異法（LSD）進行兩兩比較，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 石斛抗炎性衰老網絡藥理學研究結果

2.1.1 石斛的主要活性成分、作用靶點、蛋白互作網絡檢索到石斛主要成分28 項，得到492 個作用靶點，見圖1A。綠色菱形代表活性成分，紫色橢圓形代表靶點。通過Venny 軟件，輸入成分靶點492 個，衰老大鼠基因413 個，繪制交集韋恩圖，見圖1B，獲得石斛對衰老大鼠的作用靶點共64 個。在STRING 數據庫輸入交集基因靶點繪制PPI 網絡圖，見圖1C，節點代表作用靶點，邊代表兩兩之間互相作用關系，節點顏色越藍大小越大說明越重要。顯示石斛抗炎性衰老的關鍵核心靶點有AKT1、STAT3、NOS3、GSK3B。

圖1 網絡藥理學分析結果Fig.1 Network pharmacological analysis results

2.1.2 石斛主要成分對衰老大鼠GO 富集分析和KEGG 富集通路分析利用DAVID 數據庫對交集靶點進行生物富集分析得到GO 功能富集條目見圖2A～2C。結果顯示藥物作用于細胞質、質膜、核、線粒體等，與ATP 結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、血管內皮生長因子結合、蛋白激酶C 活性等分子功能有關，參與蛋白質磷酸化、凋亡過程、有機環狀化合物反應、對脂多糖反應、EPK1 和EPK2 級聯反應正向調節、肽基絲氨酸磷酸化、蛋白質自磷酸化、細胞遷移正向調節、肽基蘇氨酸磷酸化等生物過程，其中石斛參與生物過程中衰老最為顯著。

圖2 GO 分析和KEGG 分析結果Fig.2 GO analysis and KEGG analysis result

KEGG 富集到較為顯著20 條信號通路見圖2D，主要有：PI3K-AKT、Calcium、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、HIF-1、Apelin、VEGF等信號通路，通路上多個基因與炎癥的發生發展關系密切。PI3K-AKT 是炎癥反應中的關鍵通路。VEGF、HIF-1、Apelin 3 個信號通路中多個基因參與NO 的合成，間接影響炎性因子合成。在PI3K-AKT、RAP1 信號通路中，通過PI3K→AKT→NF-κB調節細胞因子合成促進炎癥。在AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 中，可能通過PKC 和AKT 調節NF-κB（相關通路PI3K-AKT 通路、鈣通路），間接調節IL-6、TNF-α、IL-1 合成。

2.2 主要活性成分和核心靶點的分子對接

對靶點和成分進行篩選，見表1、表2，Degree（節點的度值）表示與此節點有聯系的節點的數量。對靶點AKT1、STAT3、NOS3、GSK3B和成分齒葉黃皮素（Dentatin）、吳茱萸次堿（Rutaecarpine）、紫花前胡（Nodakenetin）、吳茱萸堿（Evodaiamine）分別進行分子對接，見圖3、圖4、表3，紫色分子為靶點，綠色部分為靶點與活性成分結合部位，藍色分子為活性成分。以結合能作為判斷成分與靶點結合能力大小的標準，結合能小于0 表示可以自由結合，越小更易發生結合。結合后出現氫鍵表示二者結合穩定，提示較好的結合關系。結果顯示各成分與各靶點間均能形成數量不等的氫鍵，AKT1 與各活性成分、GSK3B與除紫花前胡外的成分、STAT3 和NOS3 與齒葉黃皮素、吳茱萸堿結合能均小于-5 KJ/mol，表示結合情況良好。

圖3 分子對接可視化局部圖Fig.3 Partial diagram of molecular docking

圖4 分子對接可視化整體圖Fig.4 Overall diagram of molecular docking

2.3 石斛對IL-6 與IL-10 蛋白表達的影響

ELISA 測得IL-6、IL-10 濃度，使用SPSS 軟件分析，見圖5。

圖5 不同給藥對IL-6、IL-10 的影響Fig.5 The effect of different susstances on the expression of IL-6、IL-10

中劑量組血清中IL-6 含量較空白組（P＜0.01）、百令組（P＜0.01）、低劑量組（P＜0.05）相比均降低，差異具有統計學意義，提示中劑量石斛可以更好的降低IL-6 含量。低劑量組、高劑量組、百令組血清與空白組相比、高劑量組與低劑量組相比，IL-6 的含量也有所下降，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

低劑量組較空白組血清中IL-10 含量升高，差異具統計學意義（P＜0.05），較其它組含量升高但不具有統計學意義，提示低劑量石斛能更好的增加IL-10 含量。中劑量組、高劑量組、百令組與空白組相比、中劑量組與高劑量組與百令組相比，IL-10 含量增加但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

3 討論

本研究通過網絡藥理學篩選石斛主要活性成分，預測其作用靶點和抗衰老作用機制，對石斛抗衰老的機制進行了初步探討，并通過分子對接和動物實驗進行驗證，闡明了石斛抗炎性衰老的物質基礎和作用機制，可在實踐中為石斛的應用提供新的啟示。

本研究檢索到石斛活性成分28 項，獲得潛在靶點492 個、交集靶點64 個。通過PPI 網絡得到核心靶點有AKT1、STAT3、NOS3、GSK3B，這4種蛋白都對炎癥通路具有調節作用。NF-κB可調節IL-6 的生成[22]，AKT1（蛋白激酶Bα）是其上游基因[23]，是PI3K 通路的中心環節，抑制AKT會使IL-6 表達下降[24]，而活化的STAT3（信號轉導和轉錄激活因子3）可激活NF-κB信號通路，加劇炎癥反應[25]；GSK3B 是糖原合成酶激酶3β，其活性受AKT 的調節[26]，上升可以促進IL-10合成增加；NOS3（一氧化碳合酶3）可誘導NO 合成來促進IL-6 的生成[27]。對石斛成分進行篩選得到齒葉黃皮素、紫花前胡、吳茱萸次堿、吳茱萸堿四種主要活性成分。紫花前胡可通過抑制NFκB信號通路而對炎癥有抑制作用[28]。吳茱萸堿是生物堿類的一種，可抑制巨噬細胞、單核細胞、小膠質細胞抗炎因子的產生，并減少中性粒細胞中活性氧的產生，具有抗炎活性[29]。吳茱萸次堿可改善炎癥小鼠模型的炎癥反應，調節免疫平衡[30]。

在KEGG 富集到的通路中，PI3K-AKT 是炎癥反應中的關鍵通路，激活可以促進炎癥。PI3KAKT、RAP1、AEG-RAGE、EGFR 等信號通路中抑制AKT 可對NF-κB調控使IL-6 表達下降[31]。在FOCAL ADHESION、PI3K-AKT、LIPID AND ATHEROSLEROSIS 等信號通路中，提升GSK3B活性可增加IL-10 轉錄。同時，下調AKT 和NFκB的活性也可促進IL-10 的轉錄，使體內炎癥狀態得以抑制[26]。在 Apelin、LIPID AND ATHEROSLEROSIS、EGFR 等信號通路，抑制STAT3 活性可減少IL-6 生成[25]。VEGF、Apelin、HIF-1、Calcium 等信號通路 中NOS1、NOS2、NOS3 可促進NO 合成，增強促炎介質如IL6 和IL8 的合成，導致炎癥嚴重程度增加[32]，對NO進行調節，可在一定程度上減緩炎癥反應的進程，改變體內炎性狀態。

分子對接結果發現，AKT1 與各活性成分、GSK3B 與除紫花前胡外的其它成分、STAT3 和NOS3 與齒葉黃皮素、吳茱萸堿對接結果良好，表明石斛主要通過以上四種成分發揮抗炎性作用，主要作用靶點是AKT1。吳茱萸堿和吳茱萸次堿為抑炎物質[29-30，33]與GSK3B 結合可促進IL-10產生，吳茱萸堿還可與STAT3 作用抑制IL-6 生成。紫花前胡作用于AKT1 減少IL-6 的產生，也可間接調節GSK3B 活性進而調節IL-10 表達[28]。結合動物實驗，石斛組能降低血清中IL-6 的含量、增加血清中IL-10 的含量，石斛可以調節細胞因子的含量來改善機體炎性狀態，進而對炎性衰老起延緩作用，與網絡藥理學預測結果一致。但IL-6 含量與IL-10 含量變化沒有直接關系，說明不同劑量石斛對IL-6、IL-10 的調節作用不同。

綜上，石斛可通過多通路、多基因對細胞因子進行調節進而影響炎癥反應而具有抗炎性衰老的功能。主要通過齒葉黃皮素、吳茱萸次堿、紫花前胡、吳茱萸堿等活性成分調控AKT1、STAT3、NOS3、GSK3B 等關鍵基因以及 PI3K-Akt、Calcium、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、HIF-1、Apelin、VEGF 信號通路調節IL-6、IL-10 表達量來達到抗炎、抗衰老的作用。但動物實驗樣本數據較小，結果是否存在普遍性還有待探究，同時機體免疫調節系統是一個極其復雜的網絡系統，不能較好地完全反映免疫功能的變化。實驗針對鐵皮石斛的免疫調節研究仍處于比較淺顯的階段，僅證明了石斛下調促炎因子IL-6 的含量，上調抑炎因子IL-10 含量。但更深入的機制仍有待于繼續深入研究。