青蒿素調控ENO2 介導的腎透明細胞癌細胞有氧糖酵解的機制

王英寶 ，李曉云 ，譚 瑩 ，楊 萌 ，史云強 ，平秦榕 ，胡禮炳 ，楊 洋 ，王春暉

（1）昆明市延安醫院泌尿外科，云南 昆明 650051;2）青島市第八人民醫院教育科，山東 青島 266041;3）昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科，云南 昆明 650032）

腎細胞癌是泌尿系統常見的原發性惡性腫瘤之一，占成人惡性腫瘤的2%～3%[1]。腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是腎細胞癌的主要亞型，每年約有9 萬例患者死于ccRCC[2]。大多數患者在早期被確診，但約30%的患者在初始診斷時即出現轉移，晚期患者的5 a 生存率僅為32%。近來，診療技術的發展在延長了患者對的生存期，但腫瘤轉移和化療耐藥仍是ccRCC 患者預后的主要限制因素。因此，探索新的治療靶點和策略以抑制腫瘤的發展進程是ccRCC 治療迫切需要解決的問題。

Warburg 效應是指在氧氣充足的條件下，腫瘤細胞通過有氧糖酵解和減少線粒體氧化磷酸化來促進營養攝取和吸收，進而快速生長和增殖。有氧糖酵解是癌癥發展的核心因素之一，其可滿足癌細胞的能量需求，用于癌癥生物質合成的糖酵解中間體，并營造微酸性環境[3]。因此。確定調節有氧糖酵解的調控機制至關重要。

青蒿素（Artemisinin）是一種含過氧基團的倍半萜內脂，主要來源于青蒿，是治療惡性瘧疾的一線藥物。隨著深入研究發現，青蒿素除了具有抗瘧疾作用外，還具有抗腫瘤、抗炎等生物學作用[4]。然而，目前關于青蒿素對ccRCC 糖酵解的作用機制尚不清楚。烯醇化酶2（Enolase 2，ENO2）是烯醇化酶家族的重要成員，其催化磷酸烯醇式丙酮酸的合成以介導糖酵解和糖異生[5]。Chen等[6]報道，ENO2 在ccRCC 中表達升高。目前，關于ENO2 在ccRCC 中的作用機制尚不清楚。因此，本研究將探討青蒿素調控ENO2 對ccRCC 糖酵解的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

人腎皮質近曲小管上皮細胞HK2 和ccRCC細胞系OSRC2 和ACHN 購自武漢普諾賽。si-NC和si-ENO2#1、si-ENO2#2、si-ENO2#3 由上海Genepharma 合成。CCK-8 試劑盒購自上海碧云天。葡萄糖測試盒和乳酸測試盒購自南京建成生物工程研究所。逆轉錄試劑盒購自日本Takara。一抗、二抗和ECL 化學發光液購自北京博奧森。

1.2 細胞培養

HK2 和ACHN 細胞分別在MEM 培養基內培養，培養基內含NEAA，10%胎牛血清和1%雙抗。OSRC2 細胞在DMEM 培養基內培養，培養基內補充有10%胎牛血清和1%雙抗，細胞培養基置于恒溫細胞培養箱內培養，溫度為37 ℃，含5% CO2。

1.3 細胞轉染

根據試劑盒說明書，利用Lipofectamine 3000分別將si-NC 和si-ENO2#1、si-ENO2#2、si-ENO2#3 轉染至OSRC2 和ACHN 細胞系中。在培養基內培養48 h，收集細胞檢測轉染效果。

1.4 CCK-8 檢測細胞存活率

CCK-8 試劑盒用于評估細胞存活率。OSRC2和ACHN 細胞分別接種至96 孔板中，密度為6×103/孔，并將細胞暴露在0、10、20、30、40 μmol/L青蒿素環境中或轉染si-NC 和si-ENO2。細胞置于培養箱內培養，在對應時間點加入20 μL CCK-8溶液與細胞共同孵育2 h。酶標儀檢測450 nm 處的光密度值。

1.5 試劑盒檢測葡萄糖消耗和乳酸生成

葡萄糖測試盒和乳酸測試盒用于測定細胞的葡萄糖消耗和乳酸生成量。將各組細胞接種至96孔板中37 ℃孵育過夜。收集細胞，充分裂解后分別用于葡萄糖消耗和乳酸生成檢測。

1.6 總RNA 提取和RT-qPCR 實驗

使用TRIzol 試劑提取細胞中的總RNA，逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。以GAPDH 作為內參，cDNA 為模板，使用SYBR Green PCR 試劑盒進行RT-qPCR 反應，反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 50 s 進行45 個循環。2-ΔΔCt法用于計算目的基因的相對表達水平。

1.7 Western blot

細胞用RIPA 試劑裂解，10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質。然后轉移至PVDF 膜上。在室溫中用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后與稀釋后的一抗（HK2：1∶500，LDHA：1∶500，GAPDH：1∶5 000，ENO2：1∶1 000）4 ℃過夜孵育。次日，漂洗PVDF 膜并與稀釋后的二抗在室溫中孵育2 h。TBST 漂洗，滴加ECL 化學發光液至膜上，凝膠成像儀顯影。上述實驗均進行3 次重復。Image J軟件進行定量分析。

1.8 統計學處理

GraphPad Prism 8.0 軟件用于分析數據和圖片繪制，數據表示為平均數±標準差（xˉ± SD）。2 組間數據比較采用學生t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較采用Tukey’s 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青蒿素抑制ccRCC 細胞存活和糖酵解

CCK-8 檢測細胞存活率，見圖1A 和圖1B。隨著青蒿素濃度的增加，細胞存活率降低，OSRC2 細胞的IC50為25.47 μmol/L，ACHN 細 胞的IC50為26.31 μmol/L，后續選擇25 μmol/L 青蒿素處理細胞。隨后，探索25 μmol/L 青蒿素處理細胞不同時間對OSRC2 和ACHN 細胞存活率的影響，見圖1C 和圖1D。青蒿素處理時間增加細胞存活率降低，且呈時間依賴性。試劑盒分別檢測癌細胞的葡萄糖消耗和乳酸生成水平，見圖1E、圖1F，結果發現25 μmol/L 青蒿素處理后細胞的葡萄糖消耗（P＜0.01）和乳酸生成量（均P＜0.05）低于NC 組。Western blot 結果表明，青蒿素處理組中HK2 和LDHA 表達低于NC 組，且差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1G-I。綜上表明，青蒿素可抑制OSRC2 和ACHN 細胞存活率和糖酵解。

圖1 青蒿素抑制ccRCC 細胞存活率和糖酵解Fig.1 Artemisinin repressed the survival rate and glycolysis of ccRCC cells

2.2 青蒿素下調ENO2 在癌細胞中的表達

ENO2 被報道通過激活和增強糖酵解促進腫瘤細胞的生長[7]。然而，目前關于ENO2 對ccRCC細胞糖酵解的作用尚不清楚。RT-qPCR 和Western blot 檢測表明，OSRC2 和ACHN 細胞中ENO2 mRNA（圖2A）和蛋白（圖2B 和圖2C）水平高于HK2細胞（P＜0.01）。經青蒿素處理的OSRC2 和ACHN細胞中，ENO2 mRNA（圖2D，P＜0.05）和蛋白（圖2E 和圖2F，P＜0.001）水平明顯低于NC 組。綜上表明，青蒿素下調ENO2 在OSRC2 和ACHN細胞中的表達。

圖2 青蒿素下調ENO2 在癌細胞中的表達Fig.2 Artemisinin inhibited the expression of ENO2 in ccRCC cells

2.3 青蒿素通過下調ENO2 抑制OSRC2 和ACHN 的存活率和糖酵解

隨后，探討青蒿素通過調控ENO2 的表達對ccRCC 細胞活力和糖酵解的作用。將si-NC 和si-ENO2 分別轉染至OSRC2 和ACHN 細胞，轉染si-ENO2#2 和si-ENO2#3 可降低ENO2 在癌細胞中的表達（P＜0.001），見圖3A～3B。轉染si-ENO2同時經青蒿素處理組中ENO2 的表達低于僅轉染si-ENO2 組（P＜0.05），見圖3C～3D。CCK-8 和試劑盒檢測表明，敲降ENO2 可降低OSRC2 和ACHN 細胞存活率（圖3E，P＜0.01）以及葡萄糖消耗量（圖4A，P＜0.05）和乳酸產生（圖4B，P＜0.05）。同時經青蒿素處理且敲降ENO2 組中細胞的存活率低于僅敲降ENO2 組（P＜0.001），葡萄糖消耗（P＜0.05）和乳酸生成（均P＜0.05）較敲降ENO2 組減少。Western blot 結果發現，敲降ENO2明顯降低HK2 和LDHA 在OSRC2 和ACHN 細 胞中的表達（P＜0.05），見圖4C～4E，經青蒿素處理進一步下調細胞中HK2 和LDHA 的表達（均P＜0.05）。綜上表明，青蒿素通過下調ENO2 在OSRC2 和ACHN 細胞中的表達，降低癌細胞的活力和糖酵解。

圖3 青蒿素通過下調ENO2 抑制癌細胞活力Fig.3 Artemisinin repressed cancer cell viability by downregulating ENO2 expression

圖4 青蒿素通過下調ENO2 抑制癌細胞糖酵解Fig.4 Artemisinin repressed cancer cell glycolysis by downregulating ENO2 expression

3 討論

ccRCC 具有較高的發病率和死亡率，是最致命的泌尿系統惡性腫瘤之一。然而，即使患者即使接受了手術切除和放療，仍有30%的患者發展為轉移期[8]。了解ccRCC 的病理機制和探索新的治療策略十分重要。本研究發現，青蒿素可通過調控ENO2 抑制OSRC2 和ACHN 細胞的存活率并抑制癌細胞的糖酵解過程，表明青蒿素具有良好的抗癌功能。

青蒿素的抗腫瘤作用是近來研究的熱點，不僅可以單獨作用于腫瘤細胞，還可與其他藥物聯合使用。在食管癌細胞中，青蒿素通過靶向抑制HIF-1α 抑制癌細胞的增殖、轉移和糖酵解，抑制食管癌的發展[9]。青蒿素通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活，進而誘導葡萄膜黑色素瘤細胞線粒體膜電位喪失，抑制癌細胞的遷移和侵襲[10]。青蒿素衍生物雙氫青蒿素激活抗存活未折疊蛋白反應并上調CHAC1 的表達，誘導原代肝細胞的鐵死亡[11]。雙氫青蒿素可提高ROS 水平和損害血紅素代謝，降低EGFR 突變型非小細胞肺癌對奧希替尼的耐藥性[12]。筆者的研究發現，青蒿素可降低ccRCC 細胞系的存活率并抑制細胞的糖酵解，抑制ccRCC 的進程。此外，Yu 等[13]報道青蒿素和AKT 抑制劑的聯合使用可增強對ccRCC 細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用。

糖酵解是腫瘤細胞發育過程中常見的代謝途徑，增殖細胞中的糖酵解活性增加，抑制糖酵解可抑制癌細胞的發展進程。敲降circME1 通過下調ME1 的表達，抑制ccRCC 的有氧糖酵解[14]。PGK1 通過激活CXCR4/ERK 信號通路并加速糖酵解，促進ccRCC 的腫瘤發生和索拉非尼耐藥性[15]。PFKFB3 敲降抑制腎細胞癌細胞的糖酵解、增殖率和細胞周期G1/S 期轉化[16]。Trim21 通過泛素化介導的HIF-1α 降解抑制腎細胞癌細胞的糖酵解，并抑制腎細胞癌細胞體外和體內的增殖、腫瘤發生和轉移[17]。筆者的研究發現，青蒿素或敲降ENO2 可抑制OSRC2 和ACHN 細胞的活力及糖酵解過程。

ENO2 是糖酵解中的一種限速酶，促進2-磷酸甘油酸酯轉化為磷酸烯醇丙酮酸。同時，研究發現，ENO2 也是包括頭頸鱗狀細胞癌[18]、肺癌[19]、乳腺癌[20]等腫瘤的成熟生物標志物，促進腫瘤的發生與發展。例如：ENO2 過表達促進乳腺癌細胞的增殖和遷移[7]；敲降ENO2 可促進結直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解[21]；上調ENO2 的表達促進鼻咽癌細胞的放療抵抗[22]；ENO2 可促進急性淋巴細胞白血病細胞的增殖、糖酵解和糖皮質激素抵抗[23]。Pan 等[24]報道，ENO2 高水平的患者在腫瘤微環境中可能有較高的M2 巨噬細胞和較低的 γβT細胞，可能與ccRCC 患者預后較差有關。ENO2 可促進ccRCC細胞的增殖、侵襲和遷移[6]。筆者的研究發現，ENO2 在ccRCC 細胞系OSRC2 和ACHN 細胞中表達升高，青蒿素可下調ENO2 在癌細胞中的表達，敲降ENO2 降低OSRC2 和ACHN 細胞活力和糖酵解。

綜上所述，研究發現，青蒿素通過下調ENO2在OSRC2 和ACHN 細胞中的表達，降低癌細胞的存活率并抑制糖酵解過程，進而抑制ccRCC 的發展。