miR-148a-3p 靶向SMURF2 調節牙髓干細胞和口腔上皮細胞共培養體系成骨分化及牙釉質發育的作用機制

徐 倩，崔玉梅，馬思明，林云紅，熊依菁，宋子珺，李旭東

（昆明醫科大學附屬口腔醫院口腔修復科，云南 昆明 650106）

在牙科相關疾病中，牙齒的缺損或缺失已經成為全國主要的公共衛生和社會經濟問題之一，組織工程體外牙再生技術有望解決這一問題[1]。以膠原蛋白凝膠為載體，成骨細胞與上皮細胞相互作用激活特定信號通路，通過使牙源性的間充質干細胞和上皮細胞相互作用可能實現體外牙齒誘導發生。發育過程中任何信號的干擾和突變都可能導致牙釉質形成的障礙，如釉質發育不全（amelogenesis imperfecta，AI）。牙釉質是羥磷灰石晶體按照一定的順序相互排列形成堅硬的礦化組織，牙釉質保障了患者牙齒咬合功能[2]。除此之外，基層的成釉因子的分泌和晶體礦化能力，也一定程度上影響了牙釉質的形成[3]。目前有研究通過牙髓間充質干細胞與上皮細胞三維共培養，形成早期牙齒上皮內陷樣結構[4]，但是牙源性間充質干細胞與上皮細胞相互作用機制還未闡明。因此尋找牙源性間充質干細胞成骨細胞分化和調節牙釉質發育的基因靶點、探討牙釉質發育的分子機制對提高牙釉質發育狀況密切相關。有研究表明，微小RNA（miRNA）存在于成骨細胞細胞核內，作為非編碼小分子，不但參與干細胞分裂、成骨細胞的分化與破骨細胞凋亡，而且影響著牙釉質生成和恢復的過程[5-6]。最近研究發現，miR-148a-3p 存在于骨髓間充質干細胞中[7]，但是對于成骨分化的作用有爭議[8-9]，在牙源性間充質干細胞中的作用也還不清楚。為探究miR-148a-3p 在牙源性間充質干細胞成骨細胞分化和調節牙釉質發育中的作用及可能涉及靶向機制，觀察過表達和抑制miR-148a-3p 對干細胞成骨細胞分化和調節牙釉質發育的影響，闡明其作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

人牙源性間充質干細胞選擇牙髓干細胞，從健康受試者的第三磨牙牙髓獲得；人正常口腔上皮細胞從健康受試者的牙齦組織獲得。DMEM/F12 培養液、ASAP、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均采自Gbico 公司；Matrigel 基質凝膠購自康寧公司；TRIzol 試劑、Lipofectamine 2000 來自Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒和SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒，購自Ta Ka Ra 公司；miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p 抑制劑和miR-NC購自賽默飛公司；MTT 細胞增值檢測試劑盒購自Sigma 公司；雙熒光素酶報告檢測系統，購自Promega 公 司；RUNX2、E-cadherin、SMURF2、β-actin 抗體、HRP、標記的羊抗兔或鼠IgG 二抗來自Abcam 公司。本研究簽署患者知情同意并經昆明醫科大學附屬口腔醫院倫理委員會批準通過（KYKQ2020MECO20）。

1.2 細胞培養及轉染

在DMEM/F12 培養液中，加入20%牛胎血清、100 kU/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素，在37 ℃和5%CO2條件下培養牙髓干細胞。當細胞融合率達到60%時，按照脂質體TM 2000 的轉染方法轉染。將細胞分成3 組，即miR-148a-3p 組（轉染miR-148a-3p mimics）、miR-148a-3p 抑制劑（轉染miR-148a-3p inhibitor）和NC 組（轉染miR-NC），每組設3 個復孔。

1.3 三維共培養體系建立

將牙髓干細胞以1×106cells/mL 的密度接種到Matrigel 基質凝膠上，培養24 h，將口腔上皮細胞以5×105cells/mL 的密度接種到牙髓干細胞表面，培養1 d 后更換為無血清培養基。培養4 d后，將共培養轉為氣液界面培養，即將培養基減量到不覆蓋細胞層。繼續氣液界面培養，1 周后采用 Corning Dispase 收獲細胞進行分析。

1.4 qPCR 法檢測細胞中miR-148a-3p 表達水平

用TRIzol 試劑盒提取細胞總RNA，并根據反轉錄試劑盒的指令進行逆轉錄合成cDNA。用qPCR 裝置進行檢測。反應條件：95°預變性15 s，95°10 s，60°20 s，72°30 s，共40 個循環。以U6 為內參，用2-△△Ct法計算各組組織和細胞中miR-148a-3p 的表達水平。

1.5 MTT 法檢測細胞的增殖能力

三維共培養細胞收獲后將各組細胞接種到96孔板上，分3 組：正常對照組（Con），miR-148a-3p 抑制劑和NC 組，每個孔設置3 個復孔，每孔加入100 μL 新鮮培養基，每隔 24 h、48 h、72 h和96 h 后，更換新鮮培養器，在每個孔中加入20 μL 的MTT 試劑，在培養器中再培養4 h，然后丟棄MTT 液。加入150 μL DMSO，充分溶解后，檢測490 nm 波長的光密度（D）。將D 值（縱坐標）和時間（橫坐標）繪制生長曲線。

1.6 熒光素酶報告實驗

將SMURF2 3＇ UTR 中含有預測的miR-148a-3p 潛在結合位點的部分片段構建到psiCHECK-2載體中（SMURF2-wt reporter）。此外，構建含有miR-148a-3p 結合位點突變的SMURF2-mut 報告基因載體。轉染前1 d 將牙髓干細胞以每孔5×104個細胞的密度接種于24 孔板中。使用Lipofectamine 2000 將相應的報告基因載體和miR-148a-3p 模擬物共同轉染細胞。按照制造商的說明，使用雙熒光素酶報告檢測系統在轉染后48 h分別測量Renilla 和Firefly 的熒光素酶活性。實驗重復3 次。

1.7 WB 法檢測細胞中成骨細胞分化和調節牙釉質發育相關蛋白的表達

采用細胞總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度后進行SDS-PAGE、轉膜，用含5%脫脂奶粉的PBS 溶液室溫封閉1 h。加入稀釋比例均為1∶1 000 的RUNX2，E-cadherin及β-actin 一抗，4℃過夜。次日，洗膜后，加入HRP 標記的羊抗兔或鼠Ig G 二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，于暗室中用ECL 發光，并采用Image J 軟件進行圖像分析。以目的蛋白條帶的灰度值與內參照β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學處理

采用SPSS26.0 軟件對實驗數據進行系統分析。各實驗指標條件間采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-148a-3p 調控牙髓干細胞增殖

牙髓干細胞轉染miR-148a-3p 抑制劑后，三維共培養得到的細胞進行MTT 檢測，發現細胞活力明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組細胞MTT 活力檢測Fig.1 MTT Detection of cell viability與Con 比較，*P＜0.05。

2.2 miR-148a-3p 上調成骨細胞分化（RUNX2）和牙釉質發育標志物（E-cadherin）蛋白表達水平

牙髓干細胞轉染miR-148a-3p mimics，RTPCR 檢測miR-148a-3p 表達水平變化。相比NC 組，miR-148a-3p mimics 組的miR-148a-3p表達水平明顯增加（P＜0.05），見圖2A。

圖2 Western blotting 法檢測miR-148a-3p 對RUNX2 和N-cadherin 蛋白表達水平的影響Fig.2 The effects of miR-148a-3p on the expression levels of RUNX2 and N-cadherin proteins were detected by Western blotting

聯合口腔上皮細胞進行三維共培養之后，Western blotting 法檢測成骨細胞分化（RUNX2）和牙釉質發育標志物（E-cadherin）蛋白表達水平變化。結果表明，相比NC 組，miR-148a-3p 組的RUNX2表達水平和N-cadherin 表達水平明顯增加（P＜0.05），見圖2B。

2.3 miR-148a-3p 結合SMURF2 3＇-UTR

Targetscan 預測表明，SMURF2 mRNA 的3＇-UTR 有miR-148a-3p 的互補結合位點（圖3A）。筆者構建了SMURF2 3＇-UTR 的熒光素酶報告質粒，轉染牙髓干細胞，進行雙熒光素酶報告實驗。結果表明，miR-148a-3p mimics 抑制野生型載體的熒光素酶活性（圖3B，P＜0.05），但是對突變型載體的熒光素酶活性沒有影響（P＞ 0.05）。同時Western blot 結果顯示（圖3C），miR-148a-3p mimics 下調SMURF2 的表達（P＜0.05），說明SMURF2 是miR-148a-3p 的潛在的靶基因。

圖3 miR-148a-3p 通過結合SMURF2 3＇-UTR 調節SMURF2 表達水平Fig.3 miR-148a-3p regulates SMURF2 expression by binding to SMURF2 3-’ UTR

3 討論

牙釉質是羥磷灰石晶體按照一定的順序相互排列形成堅硬的礦化組織，釉柱與釉間柱有序組合使釉質在具備硬度的同時兼具一定彈性。目前研究證實，多種干細胞包括牙源性間充質干細胞和上皮細胞共同培養可以分化出骨細胞及牙釉質，形成牙體[10]。牙髓干細胞來源于牙髓組織，具有強大的自我更新能力和多向分化潛能，在組織工程中具有巨大的應用潛力。研究已證明牙髓干細胞與上皮細胞三維共培養，可以形成早期牙齒上皮內陷樣結構（早期牙齒發育的關鍵特征）[4]。但是牙髓干細胞和上皮細胞之間的相互作用機制尚未闡明。目前大量文獻表明[11-12]，miRNA 作為遺傳信息的載體，通過參與體內蛋白質合成，調節細胞增殖、凋亡等過程。當miRNA 調節功能失調將會引起細胞功能失調從而出現癌變。近年來，國內外實驗室通過多種手段，觀察分析小鼠牙胚組織發育過程中miRNAs 的轉錄表達，可見miRNA 與牙胚的生長發育過程密切相關。因此測定特定miRNA 表達變化在干細胞成骨細胞分化和調節牙釉質發育中過程中發揮著極其重要的作用，揭示其分子作用機制，具有較高的學術研究和指導價值。

miR-148a-3p 是一種多功能的調節因子，可以抑制腫瘤細胞發生轉化[13]，可能參與脂肪細胞分化[14]。Tian 的研究顯示miR-148a-3p 通過靶向賴氨酸特異性去甲基化酶6b 抑制成骨細胞分化[8]，但是Sheng[9]研究表明miR-148a-3p 也可以通過激活Wnt 通路和靶向DKK1 促進強直性脊柱炎成纖維細胞的成骨分化。miR-148a-3p 在牙源性間充質干細胞成骨分化中的作用，以及是否參與牙釉質的發育還不清楚。

筆者利用miR-148a-3p 抑制劑下調牙髓干細胞中miR-148a-3p 的水平，然后對三維共培養得到的混合細胞檢測，發現細胞的增殖受到抑制，提示miR-148a-3p 參與了牙髓干細胞的生物學行為和相關作用。最近研究表明[15]，過表達miR-148a-3p 可以促進牙齦成纖維細胞的增殖，牙髓干細胞是否存在相同機制還需要進一步驗證。

筆者利用miR-148a-3p mimics 上調牙髓干細胞中miR-148a-3p 水平，結果發現三維共培養的細胞中，RUNX2 和E-cadherin 表達水平明顯上調。RUNX2 是骨發育和骨再生過程中的關鍵調控因子，參與骨骼發育過程調節[16]；E-cadherin 參與牙胚的發育，E-cadherin 在成釉前細胞中表達上調，在牙齒形態發生、細胞分化，尤其是在牙體形成過程中起重要作用[17-18]。因此推斷，miR-148a-3p 可能調控牙發育過程中的成骨分化和牙釉質發育。

研究進一步通過 TargetScan 軟件預測SMURF2（SMAD 特異性 E3 泛素蛋白連接酶2）3＇-UTR 存在miR-148a-3p 結合位點。作為 E3 連接酶，SMURF2 具有調節多種蛋白質穩定性的重要功能，從而維持細胞遷移、增殖和凋亡等生理過程[19]。Schminke 等[20]研究發現SMURF2 誘導成骨細胞中RUNX2 降解，SMURF2 的缺乏增強了成骨細胞的分化。Zhao 等[21]發現過表達SMURF2抑制表達腎近端小管上皮（HK-2）細胞中Ecadherin 的表達。所以筆者推測miR-148a-3p 在牙髓干細胞中可能通過靶向SMURF2 上調RUNX2水平，促進成骨分化并可能通過細胞間相互作用，比如外泌體等靶向上皮細胞中SMURF2，調節Ecadherin 水平。

綜上所述，miR-148a-3p 可能通過靶向SMURF2 調節成骨分化及牙釉質發育，在牙源性間充質干細胞和上皮細胞共同誘導的體外牙齒發生中發揮作用，提示miR-148a-3p 可作為牙齒修復和治療的潛在靶標之一。