妊娠期糖尿病宮內高血糖環境對子代外周炎癥反應的影響

趙亞玲 ，武 坤 ，王 凱 ，黃 蓉 ，何根婭 ，納玉輝 ，何 苗 ，丁臻博 ，張彩營

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院兒內科;2）醫學檢驗科;3）產科，云南 昆明 650032）

大量研究表明生命早期胎兒腦發育關鍵時期宮內異常環境可導致胎兒大腦結構、功能和發育異常，最終出生后患神經、精神及行為障礙的風險增加[1-2]。妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是一種孕期特發的多系統代謝紊亂性疾病[3]，目前臨床隊列研究已證實GDM 對子代遠期認知功能的影響，主要表現在記憶力障礙、注意力缺陷/多動障礙、孤獨癥譜系障礙、智力障礙及特定學習障礙等行為異常[4]。然而目前GDM子代神經行為異常的機制尚不清楚。此外，GDM母親孕期血糖的控制是否就能完全改善子代遠期的不良影響仍存在爭議。近年來炎癥反應被認為是圍產期腦損傷的關鍵因素，即炎癥反應假說，該假說強調了圍產期全身性炎癥及胎兒先天免疫系統激活在發育腦中的損傷作用[5-6]。GDM 孕婦高血糖狀態及慢性全身炎癥反應及循環游離脂肪酸升高，GDM 母親炎癥狀態是否會激活胎兒的先天免疫系統？而外周先天免疫系統被激活是否會誘導腦內神經炎癥的發生及在神經炎癥中的貢獻如何？這值得進一步研究。本研究旨在初步研究孕期血糖控制良好的GDM 子代先天免疫反應情況，為進一步明確GDM 子代外周免疫反應在神經炎癥中的貢獻奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 研究對象本研究選擇2019 年11 月至2023 年5 月在昆明醫科大學第一附屬醫院產科出生的GDM 母親及孕期血糖正常母親的子代作為研究對象。

1.1.2 納入標準病例組（GDM 組）：研究期間于孕28 周前診斷為妊娠期糖尿病的單胎妊娠病例，病例組孕期血糖控制良好（GDM 孕期血糖控制良好標準：空腹血糖＜5.3 mmol/L，餐后2 h 血糖 ＜6.8 mmol/L），共108 例。對照組：選擇OGTT 值正常并與病例組相比，符合以下條件：（1）年齡近似（±1 歲）；（2）同種族、孕次相近（±1 次）、產次完全相同；（3）孕周37～42 周；（4）同年在昆明醫科大學第一附屬醫院產科分娩的單胎妊娠。共150 例。

1.1.3 排除標準[7]（1）孕期未在昆明醫科大學第一附屬醫院產科定期產檢；（2）缺乏母親OGTT 資料；（3）妊娠前有1 型或2 型糖尿病，或并發多囊卵巢綜合征；（4）胎齡＜37 周；（5）有其它妊娠并發癥（高血壓、腎臟、心血管疾病、甲亢、柯興綜合征、肢端肥大癥、嗜絡細胞瘤和胰島a 細胞瘤及無肝臟疾病）；（6）有出生缺陷或轉至新生兒病房住院的新生兒；（7）孕期及分娩前合并感染。

本研究獲得昆明醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（Kmmu20220828）及新生兒家長的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 GDM 篩查方法和診斷標準具有GDM 高危因素的孕婦在首診時（≤12 周）即接受75 g 口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT），若血糖水平正常于妊娠24～28 周復查。對其余全部低危孕婦于24～28 周直接進行OGTT。GDM的高危因素包括以下情況：孕婦年齡≥35 歲；糖尿病家族史；既往不良孕產史（自然流產、畸胎、死胎、早產、新生兒死亡、巨大胎兒及羊水過多）；本次妊娠過程異常（早孕時妊娠劇吐、反復鏈珠菌感染或泌尿系感染、羊水過多及胎兒生長大于孕齡兒）；孕前體重≥75 kg 或BMI≥24 kg/m2；孕前多囊卵巢綜合征。GDM 診斷標準：采用國際妊娠合并糖尿病研究組（International Association of Diabetes and Pregnancy Study Group，IADPSG）推薦的診斷標準（75 g OGTT）：服糖前及服糖后1 h、2 h 3 項血糖值應分別低于5.1、10.0、8.5 mmol/L（92、180、153 mg/dL），任何一項血糖達到或超過上述標準即診斷為GDM[8]。孕前肥胖診斷標準：BMI≥30 kg/m2。

1.2.2 GDM 的治療對診斷為GDM 的患者按國際標準[9]給予飲食控制，按30 kcal/d 計算熱卡供給，定制食譜，其中碳水化合物供熱占40%～50%，蛋白質占20%～30%，脂肪占30%。定期監測GDM 患者的血糖水平及同步尿酮，若空腹血糖3.3～5.3 mmol/L、餐后2 h 血糖4.4～6.7 mmol/L且同步尿酮陰性，則繼續維持飲食控制直至分娩；若空腹血糖 ＞ 5.3 mmol/L、餐后2 h 血糖 ＞ 6.7 mmol/L則給予胰島素治療。GDM 孕期血糖控制良好標準：空腹血糖＜5.3 mmol/L，餐后2 h 血糖＜6.8 mmol/L。

1.2.3 孕期母親臨床資料收集孕婦首診時符合病例入選標準的，患者同意后入組，整個孕期定期隨訪。收集母親民族、年齡、受教育程度、婚姻狀態、配偶、吸煙情況、家庭收入、孕次、產次、孕前體重、身高、糖尿病及肥胖家族史，對其收集資料建立檔案及數據庫。孕期定期產檢時詳細記錄孕期飲食、孕期增重、BMI、血壓、母親妊娠期糖耐量試驗結果、治療及血糖控制情況。

1.2.4 GDM 子代出生后臍血收集經家屬和孕婦本人的同意，所有產婦在胎兒娩出后 5 min 內采集臍血5 mL，其中GDM 組有30 例同時采集臍靜脈及臍動脈，對照組有34 例同時采集臍靜脈及臍動脈，所有標本按要求處理，存放在-80 ℃的低溫冰箱里保存待測定。所有標本來源于2019年11 月至2023 年5 月在昆明醫科大學第一附屬醫院產科出生的新生兒，其中GDM 母親新生兒108 例，對照組150 例。

1.2.5 臍血炎癥細胞因子檢測采用流式CBA 技術測定臍血血清（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12P70、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ）細胞因子水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0 統計軟件進行數據統計。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊時兩樣本均數比較采用t＇檢 驗；計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 母親人口統計學參數比較

2 組母親年齡、民族、身高、孕次、產次、剖宮產率、分娩前體重及孕期增重相比，差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見表1。GDM 組母親孕前體重、孕前體質指數均高于對照組（58.4±7.5 vs 53.2±7.9，P=0.04;22.9±2.7 vs 20.5±2.5，P=0.004）（P＜0.05），見表1。

表1 GDM 組與對照組母親人口統計學參數比較[（）/n（%）]Tab.1 Maternal demographics in GDM and control group[（）/n（%）]

表1 GDM 組與對照組母親人口統計學參數比較[（）/n（%）]Tab.1 Maternal demographics in GDM and control group[（）/n（%）]

*P＜0.05。

2.2 母孕期血糖水平比較

GDM 組母親OGTT 0 h、1 h、2 h 血糖水平、孕早中期及孕晚期糖化血紅蛋白（HbA1c）水平均高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 GDM 組與對照組母親孕期血糖水平比較（）Tab.2 Comparison of maternal blood glucose levels during pregnancy between GDM group and control group（）

表2 GDM 組與對照組母親孕期血糖水平比較（）Tab.2 Comparison of maternal blood glucose levels during pregnancy between GDM group and control group（）

*P＜0.05。

2.3 GDM 組與對照組新生兒指標比較

GDM 組新生兒共108 例，男67 例，女41 例，對照組新生兒150 例，男82 例，女68 例。2 組新生兒胎齡、出生體重、身長及頭圍相比，差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見表3。

表3 GDM 組與對照組新生兒人體測量指標比較（）Tab.3 Comparison of neonatal anthropometrics between GDM group and control group（）

表3 GDM 組與對照組新生兒人體測量指標比較（）Tab.3 Comparison of neonatal anthropometrics between GDM group and control group（）

2.4 GDM 組與對照組臍靜脈血清細胞因子水平比較

GDM 組臍靜脈血清IL-6、IL-8、TNFα 水平高于對照組，差異有統計學意義（6.65±0.51vs 4.02±0.40，P=0.007；13.96±1.10 vs 7.36±0.50，P=0.040；1.27±0.10 vs 0.56±0.01，P=0.020）。GDM 組IFN-γ 水平低于對照組（5.67±0.50 vs 10.54±0.90，P=0.038）。GDM 組臍靜脈血血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12P70、IL-17、IFN-α 與對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表4。

表4 GDM 組與對照組臍靜脈血清細胞因子水平比較（）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in umbilical vein between GDM group and control group（）

表4 GDM 組與對照組臍靜脈血清細胞因子水平比較（）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in umbilical vein between GDM group and control group（）

*P＜0.05。

2.5 臍靜脈血和臍動脈血炎癥因子水平比較

為了進一步比較臍靜脈及臍動脈血標本炎癥因子水平有無差異，對GDM 組（30 例）進行臍靜脈與臍動脈血血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ 及IL-12P70 細胞因子水平比較，結果顯示GDM 組臍靜脈血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ 及IL-12P70 細胞因子水平與臍動脈血清細胞因子水平差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見表5。對對照組（34 例）進行臍靜脈與臍動脈血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ 及IL-12P70 細胞因子水平進行比較，結果顯示對照組臍靜脈血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ 及 IL-12P70 細胞因子水平與臍動脈血清細胞因子水平，差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見表6。

表5 GDM 組臍靜脈血與臍動脈血血清細胞因子水平比較（）Tab.5 Comparison of serum cytokine levels between umbilical vein blood and umbilical artery blood in GDM group（）

表5 GDM 組臍靜脈血與臍動脈血血清細胞因子水平比較（）Tab.5 Comparison of serum cytokine levels between umbilical vein blood and umbilical artery blood in GDM group（）

表6 對照組臍靜脈血與臍動脈血血清細胞因子水平比較（）Tab.6 Comparison of serum cytokine levels between umbilical vein blood and umbilical artery blood in the control group（）

表6 對照組臍靜脈血與臍動脈血血清細胞因子水平比較（）Tab.6 Comparison of serum cytokine levels between umbilical vein blood and umbilical artery blood in the control group（）

3 討論

圍產期的神經炎癥會增加整個兒童期和成年期發生神經系統疾病和神經精神疾病的風險，而外周和中樞炎癥免疫信號可以在圍產期引起中樞神經系統內的炎癥反應[2]。由于在新生兒免疫系統中缺乏預先存在的免疫記憶，先天免疫系統的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）為生物體提供了一種將自身與非自身抗原區分開來并抵御入侵的微生物和病毒的內在機制。這些受體識別不同種類的病原體，以及從受損組織釋放或由受損組織表達的內源性分子[10-11]。Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）家族是發育中大腦中研究最多的 PRR 類型[12]，Yanai 等[13]的研究顯示與非糖尿病妊娠相比，GDM 宮內高血糖環境通過TLR5 和TLR1/2 過度激活新生兒先天免疫系統，該研究首次顯示了GDM 宮內高血糖環境對新生兒先天免疫免疫反應的影響。傳統觀點認為生命早期先天免疫無法誘導免疫記憶。但越來越多的研究證實髓樣細胞（先天免疫系統的效應細胞：單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞）也顯示出記憶效應[14]。Wendeln等[15]的研究顯示外周炎癥刺激誘導腦內小膠質細胞免疫記憶，并導致小膠質細胞的差異表觀遺傳重編程，這提示先天免疫記憶在圍產期腦損傷的長期后果中起了關鍵作用，從而證實了全身炎癥反應與腦損傷這一假說。

GDM 母親及胎兒對宮內異常環境的免疫反應會影響對大腦發育至關重要的神經免疫信號。但宮內高血糖環境對子代外周炎癥反應的研究目前結論并不一致。Li 等[16]研究首先發現肥胖相關的GDM 促進子代鼠促炎性細胞因子、IL-1β 和Toll 樣受體活性的產生。Atègbo 等[17]的研究顯示，與對照組相比，GDM 母親的子代臍血IL-2、IFN-r 水平顯著升高，而IL-6、TNF-α 水平顯著減低。Yanai 等[13]的研究顯示GDM 宮子代臍血細胞因子IL-8 和TNF-α 顯著高于對照組。分析其原因可能系各研究的樣本量、種族、孕期血糖控制水平及細胞因子檢測方法的不一致。為了進一步在臨床上證實GDM 對子代外周炎癥反應情況，本研究收集GDM 子代臍血進行研究。首先，為了排除其它宮內不良因素對臍血因子水平的影響，GDM 組及對照組入組病例排除感染及其它孕期并發癥。此外，在以往的研究中，大部分研究血標本來源于臍靜脈，而臍動脈血液更能反應胎兒宮內自身情況，本研究分別比較了GDM 組及對照組部分病例臍靜脈與臍動脈血清細胞因子水平，結果顯示2 組病例臍靜脈與臍動脈血清細胞因子水平差異無統計學意義，因此本研究采用臍靜脈采集血液。其次，GDM 母親孕期血糖水平與子代遠期神經行為異常相關，因此本研究選擇孕期血糖控制良好的GDM 子代作為研究對象。最后，采用流式CBA 技術測定臍靜脈血血清炎癥因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ 及 IL-12P70 水平，結果顯示GDM 子代臍血促炎癥因子IL-6、IL-8 及TNF-α 水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），筆者的研究證實了在胎兒大腦發育的關鍵時期，即使是孕期血糖控制良好的GDM 子代先天免疫系統被過度激活。Yanai 等[13]的研究同樣顯示即便是孕期血糖控制正常GDM 子代先天免疫仍然處于激活狀態，IL-8 及TNF-α 水平較正常對照組顯著增高，這與筆者的研究結論一致，但該研究中GDM 組母親孕期BMI 較對照組顯著增加，BMI 平均值為26，提示GDM 組母親孕期肥胖可能參與了新生兒先天免疫。最近的研究表明，與非肥胖大鼠相比，大鼠肥胖模型的幼崽在細菌感染和實驗誘導的先天免疫異常活躍[18]，表明母親孕期肥胖有助于新生兒先天免疫的激活。在筆者的研究中，GDM 組母親孕前體重、孕前體質指數均高于對照組，但GDM 組母親平均孕前體質指數并未達肥胖標準，孕期增重與分娩前體重與對照組比較差異無統計學意義，提示孕期未合并肥胖的GDM 母親高血糖環境仍促使子代先天免疫系統被激活。因此，筆者的研究證實了在胎兒大腦發育的關鍵時期，GDM宮內高血糖環境促使子代先天免疫系統過度激活。

綜上所述，本研究發現即使是孕期血糖控制良好的GDM 母親的子代先天免疫系統被過度激活，促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α 釋放增加，從而使其處于慢性炎癥狀態，IL-6、IL-8、TNFα 可以穿過血腦屏障，這種外周免疫信號將可能誘發腦內炎癥反應，促進腦內神經炎癥。因此，揭示GDM 對子代神經行為異常產生影響的機制、研究其早期干預措施顯得尤為迫切。找到早期干預措施將有助于從源頭上對GDM 宮內環境對子代神經行為的影響進行有效的干預，降低成人后神經行為異常的發生率。