非水溶液氯硝西泮注射劑無菌檢查法的研究

王 璐 ，向 東 ，張 艷 ，劉 勤 ，黃 珊 ，徐 帆

（1）云南省食品藥品監督檢驗研究院，工業和信息化部產業技術基礎公共服務平臺，云南 昆明 650106;2）浙江泰林生物技術有限公司，浙江 杭州 310051;3）聯勤保障部隊第九二〇醫院，云南 昆明 650032）

氯硝西泮臨床主要用于控制各型癲癇，尤適用于肌陣攣性失神發作、運動不能發作及嬰兒痙攣癥Lennox-Gastaut 綜合征[1-3]。氯硝西泮含有內酰胺和亞胺鍵，在水溶液中易水解產生雜質[4]，因此該化合物在水溶液中是不穩定的。在《中國藥典》2015 年版生效前，氯硝西泮注射液質量標準中沒有有關物質檢測項[4]，當時國內市場的氯硝西泮注射液均為水溶液，能符合當時藥典版本的標準要求。2020 年后，按《中國藥典》2020年版要求[4]，水溶液的氯硝西泮注射液無法滿足穩定性要求，不能符合現行質量標準，因此國內市場上沒有氯硝西泮注射液產品，目前屬于市場空白。現國內有藥品生產企業做藥品一致性評價，參考國外原研產品處方，注射液的輔料改用無水乙醇、冰醋酸、苯甲醇及丙二醇，注射劑規格采用用一針一水的組合，即一針氯硝西泮非水注射液加一支稀釋溶劑，臨床使用時，現場用氯硝西泮非水注射液和稀釋溶劑配制，這樣從根本上解決穩定性問題。但非水溶液的注射液的無菌檢查不屬于藥典的常規檢驗方法，研究較少，相比水溶液來說，無菌檢查方法應該考慮有機溶劑對培養器濾膜及杯體材質的影響，有的有機溶劑會與集菌培養器濾膜發生反應造成膜溶解，或者與集菌培養器杯體材質發生反應；有的有機溶劑會與培養基發生反應造成渾濁，以上情況與樣品有菌生長從而使培養基渾濁表現一致，容易造成誤判；有的對樣品內微生物的會有抑制作用。為了確保氯硝西泮注射液非水溶液無菌檢查法的準確性和可靠性，保證臨床用藥安全，現對氯硝西泮注射液中4 種有機溶劑對培養器不同材質的濾膜及杯體的影響，以及樣品溶液pH 值，沖洗液的品種及數量對樣品中微生物的影響進行研究，通過無菌檢查適用性試驗，篩選并優化方法，建立可行可靠的無菌檢驗方法[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器

HPP260eco 生化培養箱（德國美墨爾特），STI-1800DTC 無菌隔離系統（浙江泰林生物技術有限公司），210-KpH 計（BETTLER TOLEDO），AC2-4S1 級A2 型生物安全柜（ESCO Airstream），全自動過濾器膜完整性測試儀FT223（浙江泰林生物技術有限公司），集菌培養器（包含復合纖維素膜、聚偏二氟乙烯PVDF 膜、尼龍膜、丙烯腈-苯乙烯樹脂AS 杯體，聚對苯二甲酸類塑料PET 杯體，均為浙江泰林生物技術股份有限公司產品）。

1.2 試劑

氯硝西泮注射液（樣品A、B、C、D、E、F 批號分別為2107F01231、2107F02231、2107F03231、2201F01231、2201F02231、2201F03231，規 格：每支裝1 mL，以上樣品均為國內A 企業生產），硫乙醇酸鹽流體培養基（FTM 批號：20220405 北京三藥 科技開發公司），胰酪大豆胨液體培養基（TSB 批號：20220412 北京三藥科技開發公司），pH7.0 氯化鈉-蛋白胨液（批號：L2332Y 廣東環凱微生物科技有限公司），氯化鈉注射液（批號：210225-04，蚌埠豐原涂山制藥有限公司），丙二醇（批號：20211104，南京威爾藥業股份有限公司），冰醋酸（批號1803101，上海申博 化工有限公司），無水乙醇（批號：210410 1 四川西隴科學有限公司），苯甲醇（批號C-08-201201 江蘇保易制藥有限公司）。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌，批號210929［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌，批號22021［CMCC（B）44102］、生孢梭菌，批號211023［CMCC（B）64941］、枯草芽孢桿菌，批號210202［CMCC（B）63501］、白色念株菌，批號211208［CMCC（F）98001］、黑曲霉，批 號210302［ CMCC（F）98003］，以上菌珠含量均為1.0～2.0 cfu×103/顆，均購自北京三藥科技開發公司。

1.4 研究方法

1.4.1 菌液制備首先將菌珠平衡至室溫，將2 mL 復溶液加入菌珠西林瓶中，蓋好瓶蓋，混旋10 s 使其溶解，吸取1 mL 已完全溶解的菌液，加入9 mL 的氯化鈉注射液中，混勻，即為含菌量＜100 cfu/mL 的菌液[6]。

1.4.2 集菌培養器濾膜及杯體選擇實驗取樣品A60 支，按薄膜過濾法處理，分別通過復合纖維素膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜材質的培養器，培養器杯體材質均為丙烯腈-苯乙烯樹脂（acrylonitrile-styrene resin，AS），每10 支通過1 個濾筒，每種膜分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基（thioglycolate fluid medium，FTM）和胰酪大豆胨液體培養基（trypticase soy broth，TSB）。取不含氯硝西泮的空白溶劑60 mL，按上述方法處理，每10 mL 通過1 個濾筒。分別取輔料無水乙醇、丙二醇、苯甲醇、冰醋酸10 倍稀釋液60 mL，按上述方法處理，每10 mL通過1 個濾筒。陰性對照取上述培養器直接加入FTM 和TSB 培養基。

1.4.3 樣品溶液pH 范圍考察取樣品A20 支，稀釋至200 mL 的氯化鈉注射液中，選用尼龍膜，杯體材質為聚對苯二甲酸類塑料（PET）的培養器，濾膜用至少20 mL 氯化鈉注射液潤濕，上述供試液通過2 個濾筒，然后用氯化鈉注射液溶液沖洗，每膜每次100 mL，共3 次，分別加入FTM 和TSB 培養基。取樣品A20 支，稀釋液及沖洗液使用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液，同上法操作。取樣品B、D 同上法操作。

1.4.4 無菌檢查方法學適用性試驗[7]取樣品A60 支，稀釋至600 mL 的pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液中，選用尼龍膜，杯體材質為PET 的培養器，濾膜用至少20 mL pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液潤濕，每100 mL 通過1 個濾筒，然后用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液洗，每膜每次100 mL，共3 次，在最后1 次沖洗液中加入小于100 cfu 的菌液，在其中3 個濾筒內加入FTM 培養基（接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的），在其余3 個濾筒加入TSB 培養基（接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的）。取樣品BCDEF 同上操作。陽性對照不加供試品，其余操作如上，逐日觀察。

1.4.5 無菌檢查非水溶液氯硝西泮注射無菌檢查方法：取本品，選用濾膜為尼龍膜，杯體材質為PET 的集菌培養器，用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液稀釋（不少于10 倍），按薄膜過濾法處理，用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液沖洗（每膜不少于 300 mL），以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依法檢查（《中國藥典》2020 年版四部通則1101）。

2 結果

2.1 集菌培養器濾膜及杯體選擇實驗結果

氯硝西泮注射液及空白溶劑直接過濾引起培養基渾濁，且渾濁程度基本一致，說明渾濁原因不是因為氯硝西泮析出，應是有機溶劑造成。將4 種輔料拆分實驗，可以看到過濾丙二醇加入培養基后顯渾濁，將培養器做膜通透性分析，顯示膜完整，渾濁原因應是丙二醇可能與AS 杯體反應故呈渾濁。無水乙醇、苯甲醇及10 倍稀釋的冰醋酸過濾加入培養基顯渾濁，將培養器做膜通透性分析，顯示部分膜溶解，復合纖維素膜的溶解程度大于PVDF 膜及尼龍膜，渾濁原因應是膜溶解后引起培養基渾濁，見表1、圖1，無水乙醇及冰醋酸造成膜溶解，培養基漏出，故沒有照片。

圖1 集菌培養器濾膜及杯體選擇實驗結果Fig.1 Results of the selection experiment of filter membrane and cup of the incubator

表1 濾膜通透性檢測Tab.1 Filter membrane permeability test results

2.2 樣品溶液pH 范圍考察

沖洗后2 種培養基pH 范圍在5.99～7.16 之間，該pH 范圍符合絕大多數微生物生長，見表2。

2.3 無菌檢查方法學適用性試驗

供試品各培養器中試驗菌均生長良好，與陽性對照管一致，見表3，無菌檢查方法適用性試驗通過。

表3 無菌檢查方法學適用性試驗Tab.3 Test results of the suitability of sterility test methodology

2.4 無菌檢查

對氯硝西泮注射液6 個批號樣品分別進行無菌檢查，培養14 d，培養期間逐日觀察，結果供試品管均澄清，無菌生長，符合規定。陽性對照菌24 h 生長良好，陰性對照各管在培養期間無菌生長，見表4，說明此無菌檢查方法適用于該制劑。

表4 樣品無菌檢查結果Tab.4 Results of sample sterility test

3 討論

集菌培養器濾膜及杯體的選擇，將4 種輔料拆分實驗，可以看到過濾丙二醇加入培養基后顯渾濁，將培養器做膜通透性分析，顯示膜完整，渾濁原因應是丙二醇可能與AS 杯體反應故呈渾濁。無水乙醇、苯甲醇及10 倍稀釋的冰醋酸過濾加入培養基顯渾濁，將培養器做膜通透性分析，顯示部分膜溶解，復合纖維素膜的溶解程度大于PVDF 膜及尼龍膜，渾濁原因應是膜溶解后引起培養基渾濁，另外苯甲醇不溶于水，也可能殘留于杯體及濾膜的苯甲醇不溶于水性培養基引起渾濁[8]，考慮到尼龍膜比復合纖維素膜耐受性更好，而且可用于抑菌成分，吸附性低，帶支撐層，耐得住沖洗，PVDF 膜雖然兼容性也比較好，但成本過于昂貴，杯體材質PET 比AS 對酸堿及有機溶劑耐受性更好[9]，故正式實驗時，選擇濾膜為尼龍膜，杯體材質為PET，同時將樣品稀釋，并及時進行沖洗，盡量降低有機溶劑與膜或者杯體接觸的時間和濃度。

不同沖洗液沖洗后兩種培養基pH 范圍在5.99～7.16 之間，該pH 范圍符合絕大多數微生物生長[10]，考慮到該樣品本身的pH 值為4.0 左右，pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液更適合偏堿或偏酸的樣品，故選擇pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液為稀釋液及沖洗液[11]。

本研究結果顯示，非水溶液的注射劑在進行無菌檢查時需考慮的因素較多。如溶劑為有機相，應考慮有機相對集菌培養器的濾膜和杯體的材質的影響，還需考慮非水溶液的pH 值，如pH 改變時會不會造成樣品析出；非水溶液中溶劑與水性培養基是否互溶，會不會影響培養基的靈敏度[12]。還需考慮溶劑存不存在抑菌作用，如無水乙醇等存在較強抑菌作用，必須消除其抑菌作用才能進行無菌檢查[13]。沖洗液的選擇不得影響樣品中微生物的生長[14]，確保檢測結果的準確性。本研究采用薄膜過濾法，對氯硝西泮注射液的4 種有機溶劑分別進行探索研究，對培養器濾膜及杯體的材質，沖洗液的選擇及用量等條件進行了篩選[15-16]。考慮樣品的pH 值影響因素，有機溶劑的抑菌效應，經過條件優化，最終建立了非水溶液氯硝西泮注射液的無菌檢查方法：取本品，選用濾膜為尼龍膜，杯體材質為PET 的集菌培養器，用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液稀釋（不少于10 倍），按薄膜過濾法處理，用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液沖洗（每膜不少于 300 mL），以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依法檢查（《中國藥典》2020 年版四部通則 1 101）[6]，應符合規定，通過方法適用性驗證試驗證明，該方法可行、結果可靠，本研究同時給非水溶液的其他注射劑的無菌檢查提供了參考。