PEAR1 基因多態性與缺血性腦卒中的相關性研究

張云芳，莊杉杉，余 艷，李 錚，吳曉明，聶曉改

（昆明醫科大學附屬延安醫院醫學檢驗科，云南 昆明 650051）

缺血性腦卒中是由于多種因素引起的腦血管病變，發生缺血缺氧并產生組織壞死，最終導致神經功能障礙的一組疾病，約占腦卒中的60%～80%[1]。在全球，腦卒中患病率均處于較高水平，隨之而來的死亡率也逐漸引起關注，在歐美國家中，腦卒中是排在冠心病和癌癥之后的第3 位死亡原因。在我國，腦卒中嚴重威脅國民健康，已成為成人致殘甚至死亡的首位病因[2]。缺血性腦卒中致病因素多樣，具體病因尚未明確，發病機制較為復雜，基因多態性與疾病相關性成為新的研究熱點，近年來以血小板內皮聚集受體1（platelet endothelial aggregation receptor-1，PEAR1）基因多態性位點研究頗受關注。既往有研究發現，檢測冠心病和缺血性腦卒中患者的血清PEAR1水平，兩類患者的PEAR1水平均升高，進一步研究發現PEAR1基因多態性可影響冠心病患者血小板黏附聚集，導致凝血系統發生變化，有引發血栓風險，發生腦卒中或再次心梗，PEAR1基因多態性與腦卒中患者用藥及疾病預后相關[3]。然而，有研究者將PEAR1不同基因型與腦梗死發生復發不同周期比較，發現PEAR1基因多態性與腦梗死的發生及復發無相關性[4]。PEAR1基因多態性與缺血性腦卒中患者疾病發生的相關性尚存爭議。

PEAR1是血小板之間相互作用的一種跨膜受體，在血小板和內皮細胞中均有表達，其基因由23 個外顯子和22 個內含子組成，在血小板活化中起很重要的作用，參與多種血管相關疾病的發生[5-6]。在缺血性腦卒中患者血清中PEAR1水平升高，提示其與腦卒中發生可能存在關聯，PEAR1可能是腦卒中發生的一個危險因子。本研究通過分析缺血性腦卒中患者PEAR1基因位點多態性并探討其與疾病發生的相關性，為缺血性腦卒中發病機制的進一步研究及疾病治療靶點提供科學依據及研究方向。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2022 年6 月至至2023 年6 月昆明醫科大學附屬延安醫院就診的150 例缺血性腦卒中患者的臨床資料，其中男性95 例，女性55 例，年齡45～80 歲，平均（63.75±9.67）歲。另外收集同期健康人群150 例作為對照組，其中男性88 例，女性62 例，年齡45～80 歲，平均（63.66±8.81）歲。

納入標準：經核磁共振彌散成像或者CT 灌注成像（computed tomography perfusion imaging，CTP）檢查確診為缺血性腦卒中。入組患者診斷標準符合中國急性缺血性腦卒中診治指南[7]。排除標準：患有心源性栓塞、心臟疾病、癲癇、腦部創傷、血管畸形、腦腫瘤，腦出血或先天性腦部疾病的患者。該研究經昆明醫科大學附屬延安醫院醫學倫理委員會批準（2022-127-01），且患者簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器核酸提取儀（西安天隆科技有限公司）、PCR 擴增儀（上海宏石）、電泳儀（美國Bio-rad 公司）、凝膠成像系統（美國Bio-rad 公司）、熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.2.2 主要試劑人全血基因DNA 提取試劑盒（西安天隆科技有限公司）、內切酶BCCI（美國NEB 公司）、2×TaqPCRMasterMix（北京博邁德生物技術有限公司）、瓊脂糖（北京博邁德生物技術有限公司）、DNA MarkerI（北京博邁德生物技術有限公司）、核酸染料（上海愛必夢生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提取采集入組人群EDTA 抗凝靜脈血2mL。用人全血基因DNA 提取試劑盒提取缺血性腦卒中患者及健康體檢者外周血基因組DNA，方法嚴格按照試劑盒的說明書進行，提取產物-20℃保存。

1.3.2 PEAR1 目的基因擴增使用PCR 方法進行目的片段基因擴增，引物片段Forward: 5＇-CAC TAATCTTATCCCCATTTTCTAGGTG-3＇，Reverse:5＇-GCCCTCTCAGCCTCCGAGC-3＇，擴增反應總體積為25 μL，反應體系包括上下游引物各0.5 μL、DNA 模 板5 μL、2 × TaqPCRMasterMix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復35 個循環后72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察PCR 擴增產物，擴增產物片段大小為408 bp。

1.3.3 PEAR1 基因分型PCR-RFLP 方法進行基因分型，取上述擴增成功的產物2 μL，內切酶BCCI 1 μL，10×NEBuffer 5 μL，ddH2O 42 μL。放置于37 ℃恒溫箱進行至少1 h 的酶切反應然后終止。酶切產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V電壓、300 mA 電流穩壓電泳40 min，紫外燈下觀察酶切產物并根據條帶數分型。酶切后的GG 型純合子片段大小為408 bp 單個條帶，AA 型純合子大小為178 bp、230 bp 2 個條帶，GA 型雜合子大小為408 bp、178 bp、230 bp 3 個條帶，見圖1。PCR 擴增產物經電泳進行初步檢測后，取部分樣本的PCR 擴增產物和相應引物送北京博邁德生物技術有限公司進行正反2 個方向的測序分析，以進一步驗證目的片段，見圖2～圖3。

圖1 PEAR1 基因凝膠電泳條帶圖Fig.1 PEAR1 gene gel electrophoresis band

圖2 PEAR1 基因AA 基因型測序圖Fig.2 PEAR1 gene AA genotype sequencing

圖3 PEAR1 基因GA 基因型測序圖Fig.3 PEAR1 gene AA genotype sequencing

1.4 統計學處理

數據采用SPSS19.0 軟件進行分析。計量資料滿足正態分布時以（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗。用卡方檢驗對研究對象的基因型和等位基因頻率進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗。影響因素的篩選采用單因素方差分析（ANOVA）或獨立樣本t檢驗，用Logistic 回歸分析有差異的因素，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較

缺血性腦卒中組的糖尿病、高血壓比例和同型半胱氨酸（HCY）水平、高同型半胱氨酸水平比例較正常對照組高，差異有統計學意義（P＜0.05）2 組的性別、年齡、血脂間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 缺血性腦卒中組和正常對照組一般資料比較[n（%）/ ]Tab.1 Comparison of general data between ischemic stroke group and normal control group[n（%）/ ]

表1 缺血性腦卒中組和正常對照組一般資料比較[n（%）/ ]Tab.1 Comparison of general data between ischemic stroke group and normal control group[n（%）/ ]

*P＜0.05。

2.2 基因型與等位基因頻率分布

統計缺血性腦卒中組和正常對照組的基因型例數，缺血性腦卒中組和正常對照組等位基因分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞ 0.05），基因型在各組間具有群體代表性，見表2。

表2 缺血性腦卒中組和正常對照組的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗（n）Tab.2 Hardy-weinberg genetic balance test in ischemic stroke group and normal control group（n）

2.3 PEAR1 基因rs12041331 位點多態性分析

缺血性腦卒中組和正常對照組PEAR1基因rs12041331G ＞ A 位點基因型分布以及G、A 等位基因頻率，見表3。經卡方檢驗顯示，缺血性腦卒中組和正常對照組PEAR1基因rs12041331G ＞A 位點GG、GA、AA 基因型分布以及 G、A 等位基因頻率的差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 缺血性腦卒中組和正常對照組PEAR1 基因rs12041331G >A 位點基因型分布和等位基因頻率的比較[n（%）]Tab.3 Comparison of genotype distribution and allele frequency of PEAR1 gene rs12041331G>A between ischemic stroke group and normal control group[n（%）]

2.4 缺血性腦卒中發生影響因素的Logistic 回歸分析

將缺血性腦卒中組和正常對照組組間差異有統計學意義的糖尿病、高血壓、HCY、rs12041331位點GG、GA 和AA 基因型作為自變量，是否發生缺血性腦卒中（發生=1，不發生=0）作為因變量，進行Logistic 回歸分析，結果顯示：糖尿病、高血壓、HCY、rs12041331 位點GA、AA 基因型與缺血性腦卒中相關（P＜0.05），均是危險因素，見表4。

表4 缺血性腦卒中發生影響因素的Logistic 回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of influencing factors of ischemic stroke

3 討論

我國腦卒中患者隨著人口老齡化的到來逐日增多，其中以缺血性腦卒中最為常見，每年新增人數達200 萬人，其中150 萬患者因腦卒中死亡，而存活患者也不同程度喪失行動能力[8]。由此給家庭帶來巨大的精神和經濟壓力，給社會帶來沉重負擔。因此，腦卒中的早期預防和患病后及時治療尤為重要，是我國亟待解決的醫學問題。目前的防治主要從危險因素進行干預以及進行抗血栓治療，明確缺血性腦卒中發生發展過程中的可能機制，并進行有效的干預，是防治缺血性腦卒中的重要措施之一。

本研究用PCR-RFLP 方法對研究對象PEAR1基因rs12041331G ＞ A 等位基因多態性進行檢測和分析。結果顯示，缺血性腦卒中組的糖尿病、高血壓比例較正常對照組高，HCY 水平2 組均升高（HCY 實驗室正常參考范圍0～10 μmol/L），缺血性腦卒中組的HCY 水平高于正常對照組（P＜0.05）。缺血性腦卒中發生的病因不明確，飲食習慣、吸煙、患有糖尿病、高血壓等疾病以及血清高HCY 水平是目前公認的缺血性腦卒中發生的危險因素[9-10]，本研究PEAR1基因rs12041331G ＞A 位點GG、GA、AA 基因型分布以及G、A 等位基因頻率在缺血性腦卒中組和正常對照組間差異有統計學意義（P＜0.05），缺血性腦卒中組的突變基因型和A 等位基因頻率比正常對照組高。Logistic 回歸分析結果顯示糖尿病、高血壓、HCY、PEAR1基因rs12041331 位點GA、AA 基因型與缺血性腦卒中相關，A 等位基因突變是缺血性腦卒中發生的危險因素（P＜0.05）。PEAR1基因rs12041331 屬于內含子，不參與編碼氨基酸序列，但內含子附近區域變異可影響相關蛋白的表達，從而改變蛋白的功能，相關蛋白可觸發多種激動劑，使血小板發生聚集，PEAR1基因多態性與腦卒中的發生相關，與腦梗死認知功能障礙密切相關，影響腦卒中患者的預后[11]。PEAR1可通過介導PI3K/AKT 和PI3K/PTEN 信號通路影響血管內皮細胞增生、新生血管生成和血栓形成，A 等位基因突變可能通過改變激動蛋白的表達影響PEAR1介導的PI3K/AKT 信號通路，進而調節血小板的活化和聚集功能[12]。A 等位基因也可能通過影響內皮細胞的遷移而影響血栓的形成[13]。PEAR1基因rs12041331 位點SNP 與患者血小板活性增強有關，引起血小板之間發生聚集，突變型AA 純合子血小板聚集率高于野生型GG 純合子，且突變位點數越多，相應的血小板聚集率就越高；腦卒中病人使用抗血小板聚集藥物治療后的一段時間，雜合突變型GA 心血管事件發生率增高[14]。首次發生缺血性腦卒中后，長期服用阿司匹林的患者中，PEAR1基因純合突變的患者相較于另外2 種基因型患者發生腦卒中復發的風險更高，影響患者預后，帶來的危害更為嚴重[15]。PEAR1通過不同的路徑引發血小板改變、血栓形成，進而導致缺血性腦卒中發生。

本研究就PEAR1基因與缺血性腦卒中進一步研究提供了依據。PEAR1基因多態性與缺血性腦卒中的發生相關，缺血性腦卒中具有遺傳易感性，為缺血性腦卒中易感人群的篩選、患病風險評估、早期防治干預等提供科學依據，為疾病的綜合防治提供思路。