臨床分離白色念珠菌耐藥性與致病性研究

陳瑤 鄭才斌

白色念珠菌（Candida albicans）是一種常見的條件致病性真菌，在臨床上廣泛存在并引起各種感染，特別是對免疫功能低下的患者具有重要的致病性。然而，近年來，白色念珠菌對抗真菌藥物的耐藥性問題逐漸引起關注。耐藥性的出現不僅給治療帶來了挑戰，還可能導致治療失敗和疾病復發[1-2]。研究顯示，白色念珠菌是侵襲性念珠菌病的主要病原菌，也是醫院獲得性真菌感染的主要致病菌[3-4]。目前，在臨床治療中，唑類抗真菌藥物仍然是一線治療藥物，常見的有伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑等。這些藥物的作用機制主要是通過干擾真菌細胞的麥角固醇合成來抑制真菌的生長和繁殖。麥角固醇是真菌細胞壁的重要組成成分，它在維持菌體結構和功能上起著關鍵作用。唑類抗真菌藥物通過抑制麥角固醇合成酶（14α-脫甲基酶）的活性，阻斷了麥角固醇的合成，導致真菌細胞壁的形成受到影響，從而使真菌無法正常生長和繁殖。白色念珠菌的致病性與多種毒力因子密切相關，這些毒力因子協同作用，使得白色念珠菌能夠逃避宿主的免疫反應，侵襲和定植于宿主組織，并引起感染[5-6]。因此，在治療白色念珠菌感染時，除了選擇合適的抗真菌藥物外，還需要考慮控制和干擾這些毒力因子的策略，以提高治療效果。耐藥性是指白色念珠菌對抗真菌藥物的敏感性降低，從而導致藥物治療失效或需要使用更高劑量或更毒性的藥物來進行治療。耐藥性的出現主要是由于白色念珠菌的遺傳變異和選擇壓的作用[7]。本研究旨在探索白色念珠菌的耐藥性模式，并深入研究耐藥性與致病性之間的關聯。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究回顧性地分析2020 年1 月—2023 年3 月從臨床無菌部位（如胸腹水、引流液、膽汁）和血液標本中分離出的125 株經準確鑒定的白色念珠菌。包括白色念珠菌ATCC90028 和近平滑假絲酵母菌ATCC22019。

1.2 方法

為了進行抗真菌藥物的耐藥性檢測，采用微量肉湯稀釋法。

（1）配制RPMI 1640 培養基。準備所需材料：RPMI 1640 培養基粉末、蒸餾水、無菌量筒或燒瓶、調節pH 的緩沖液（如無菌的1 M HEPES 緩沖液）、CO2培養箱或無菌操作臺。粉末溶解：根據需要的量，稱取適量的RPMI 1640 培養基粉末，并將其轉移到一個干凈的容器中。加入蒸餾水：將適量的蒸餾水加入容器中，按照粉末與水的比例（通常是1 g 粉末配制成1 L 培養基），攪拌或搖晃容器，使粉末充分溶解。調節pH：使用調節pH 的緩沖液（如1 M HEPES 緩沖液），逐漸調節RPMI 1640 培養基的pH 值至所需的范圍（通常為7.2 ～7.4）。使用pH 計進行測量和調節，小心避免pH 劇烈波動。無菌過濾：將配制好的RPMI 1640 培養基通過0.22 μm 的濾膜無菌過濾器過濾，以去除潛在的微生物污染。瓶裝和儲存：將過濾后的RPMI 1640 培養基分裝到無菌培養瓶或離心管中，并密封好。標注瓶上的培養基類型、配制日期和保存條件。一般而言，RPMI 1640 培養基可以在4℃下保存數周，或在-20℃或更低溫度下冷凍保存。

（2）藥液配制。準備所需藥物：根據試驗需要，準備需要測試的抗菌藥物。通常使用已知的標準藥物粉末，按照實驗室內部的規程和藥物配方進行準備。藥物溶解：稱取適量的抗菌藥物粉末，如準備相應的抗真菌藥物的藥粉，如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B 和5-氟尿嘧啶等，并將其溶解于適量的溶劑中。溶劑可以是培養基、生理鹽水或其他適當的溶液。確保將藥物充分溶解，并形成均一的溶液。稀釋藥物：根據試驗要求和藥物的預期濃度范圍，將藥物溶液進行逐級稀釋。通常采用2 倍稀釋的方法，將藥物的濃度逐漸降低。加入培養基：將稀釋后的藥物溶液加入RPMI 1640 培養基中，使得最終藥物濃度和培養基充分混合。可以根據試驗需求，在培養基中的不同孔中添加不同濃度的藥物。混勻：輕輕搖晃或旋轉培養基和藥物的混合物，確保藥物在培養基中均勻分布。滅菌：通過過濾或高溫滅菌方法，確保配制好的藥物溶液是無菌的。使用0.22 μm 濾膜過濾器將藥物溶液過濾，以去除潛在的微生物污染。校驗藥液濃度：可使用適當的方法（如比色法或光密度計）對配制好的藥液濃度進行校驗，確保藥液濃度與試驗要求相符。實驗使用：將配制好的藥液用于體外藥敏試驗或其他相關實驗中。按照實驗設計和操作要求，在試驗板或培養皿中加入適量的藥液和細菌進行實驗。

（3）菌液配置。培養菌株：首先，準備需要測試的真菌菌株。可以從已有的純培養菌株中選擇合適的菌株，或者進行新鮮分離培養。培養基準備：配制適合真菌生長的培養基，常用的培養基包括Sabouraud 葡萄糖瓊脂培養基、Malt Extract 瓊脂培養基等。按照培養基配方的要求準備，并進行無菌處理。菌液接種：從培養基上挑取一株純培養的真菌菌株，用無菌的接種環或接種針將菌株轉移到無菌的培養基上。注意每次接種只轉移一小塊菌落或一小團孢子。培養菌株：將接種好的培養基含菌培養皿在適當的溫度下培養，一般為25 ～30℃，培養時間根據具體菌株和實驗需求而定。菌株應在適當的培養條件下生長至足夠的菌量。菌液懸浮：從培養好的菌株中挑取適量的菌落或孢子，加入一定體積的生理鹽水或緩沖液中。使用無菌的注射器或移液器將菌落均勻地懸浮在液體中，形成菌液。菌液濃度調整：根據實驗要求，通過逐級稀釋的方法將菌液進行濃度調整。通常采用2 倍稀釋的方法，將菌液的濃度逐漸降低，以獲得所需的菌液濃度。菌液保存：將調整好濃度的菌液分裝到無菌試管或培養皿中，密封保存。根據實驗需要，可以將菌液在低溫下保存，避免菌株的變異和降低菌液的活性。

（4）操作步驟。準備無菌U 型96 孔細胞培養板：獲取無菌的U 型96 孔細胞培養板。在每一排的第1 ～12 孔中，加入100 μL RPMI 1640 培養基，最后一排的第12 孔作為空白對照。配制藥液：根據所需藥物的濃度，在適當的容器中配制藥液。以氟康唑為例，配制濃度為最終使用濃度的2 倍，即12.8 mg/mL 的溶液。藥液稀釋：取100 μL 配制好的藥液加入無菌U 型96 孔細胞培養板的第1 孔中，并充分混勻。從第1 孔中吸取100 μL 液體，加入第2 孔中，并混勻。依次進行倍比稀釋，將每次稀釋后的100 μL 液體從前一孔吸取并加入下一孔中，直到第10 孔。最后，將剩余的100 μL 液體棄去。菌液接種：取100 μL 配制好的1.0×103CFU/mL 的菌液加入無菌U 型96 孔細胞培養板的第1 ～11 孔中，分別與稀釋好的藥液混合。第11 孔屬于陽性對照，只含有RPMI 1640 培養基和菌液，沒有藥液。第12 孔屬于生長對照孔，只含有RPMI 1640 培養基，無菌液和藥液。培養：將已加樣的無菌U 型96 孔細胞培養板放入37℃恒溫培養箱中培養24 ～48 h。對于氟康唑和兩性霉素B，結果可在24 h 后讀取。48 h 后讀取伊曲康唑、伏立康唑和5-氟尿嘧啶結果。在培養結束后，觀察每個孔的菌落生長情況。記錄各藥物濃度下的菌落生長情況，包括清亮（無生長）、輕微渾濁（輕微生長）、渾濁（正常生長）等。根據菌落生長情況，確定最小抑菌率。

（5）結果解讀和分析：根據菌液在不同藥物濃度下的生長情況，確定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。MIC 是指能夠抑制菌株生長的最低藥物濃度。MBC 是指能夠殺死菌株的最低藥物濃度。通過對照組的生長情況，判斷藥物的抗真菌效果。結果記錄和報告：將實驗結果進行記錄，包括藥物濃度、菌落生長情況、MIC和MBC 值等。繪制藥物對菌株的抑菌曲線或生長曲線，以圖表形式展示實驗結果。進行數據分析，比較不同藥物的MIC 和MBC 值，評估藥物的抗真菌活性。撰寫實驗報告。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，進行t檢驗；計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 125 株白色念珠菌的藥物敏感性

對于125 株白色念珠菌的藥物敏感性進行了評估。結果顯示，氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B 和氟胞嘧啶對大多數菌株表現出較高的敏感性。其中，僅有少數菌株對氟胞嘧啶表現出耐藥性，耐藥率為1.6%。而其他藥物則顯示出普遍的敏感性，見表1。

表1 125 株白色念珠菌的藥物敏感性分析

2.2 活性差異分析

關于不同感染部位的菌株之間毒力因子活性，經比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、圖1。

圖1 不同標本來源的三種毒力因子的活性差異

表2 125 株白色念珠菌的活力分布分析 [株（%）]

3 討論

白色念珠菌具有分泌型天冬氨酸蛋白酶的能力，該酶能夠在細胞外發揮作用。這種水解酶于1965 年被首次發現，其在宿主不同解剖部位和感染階段中表達出多樣性。這表明白色念珠菌通過分泌不同類型和數量的蛋白酶來適應宿主環境，并且這種酶的活性與其致病性密切相關。它具有較高的蛋白水解活性，能夠水解多種宿主底物，并在白色念珠菌的入侵和定植過程中發揮作用[8]。然而，也有一些研究報道顯示，在從感染者中分離的白色念珠菌中，只有44.4%的菌株顯示出酶的產生[9]。檢測率的差異可能受到多種因素的影響，包括樣本來源、分離人群和地理位置等。這些結果表明，了解白色念珠菌的酶產生率及其在感染過程中的表達調控機制對于深入理解其致病機制具有重要意義。

本研究中，對于125 株白色念珠菌的藥物敏感性進行了評估。結果顯示，氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B 和氟胞嘧啶對大多數菌株表現出較高的敏感性。其中，僅有少數菌株對氟胞嘧啶表現出耐藥性，耐藥率為1.6%。而其他藥物則顯示出普遍的敏感性，且不同感染部位菌株之間毒力因子活性不明顯，這與劉娜等[10]的研究結果一致 。特別是對氟康唑和伏立康唑的敏感性達到100%，與文獻中對白色念珠菌的敏感性報道一致，其耐藥率不到 1%[11]。盡管在體外藥敏試驗中，觀察到兩性霉素B 及5-氟胞嘧啶對白色念珠菌表現出較高的敏感性，但是兩性霉素B 具有一定的腎毒性，從而限制了該藥物在臨床中廣泛使用。同時，單獨使用5-氟胞嘧啶易導致耐藥性產生，因此在臨床實踐中很少獨立使用該藥物，而常與唑類藥物聯合使用。這種聯合用藥的策略旨在提高治療效果并減少耐藥性的發展。唑類藥物如氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑通常被選擇與5-氟胞嘧啶聯合使用。聯合應用這些藥物可提高治療效果，并降低耐藥性的風險，從而增加對白色念珠菌感染的治療成功率[12]。

綜上所述，本次的研究結果顯示，從臨床樣本中分離得到的白色念珠菌對常用的抗真菌藥物顯示出較高的敏感性。此外，通過對白色念珠菌的毒力因子活性進行了比較和分析，這為深入理解和揭示其致病機制提供了重要的參考。這些研究結果對于臨床治療和預防念珠菌感染具有重要的實際意義。