內質網膜蛋白4B對胃癌血管生成的影響

李 倩,王 珂,張慧敏

胃癌是常見的消化道腫瘤,患者5年生存率為18%左右[1]。胃癌細胞的增殖、侵襲是不良預后的主要原因,而新生血管會促進腫瘤侵襲和轉移,因此尋找腫瘤血管生成的生物學機制并尋找潛在治療靶點具有重要意義[2]。內質網膜蛋白4B(reticulon 4B,RTN 4B),又稱為Nogo-B,是內質網膜蛋白4家族成員之一,在肝臟、卵巢、胃和血管等組織中均有表達,在細胞增殖、侵襲、凋亡、上皮間質轉換和血管重構等病理生理學過程中發揮重要作用[3-5]。RTN 4B也會促進血管生成[6]。近年來發現,RTN 4B可能作為癌基因在卵巢癌和結直腸癌等發生發展中起到重要作用[5,7]。然而RTN 4B與胃癌的關系既往少有報道。為了探討RTN 4B在胃癌中的作用,本研究檢測RTN 4B在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達,并分析沉默或過表達RTN 4B對胃癌血管生成的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2023年1-3月在我院手術切除的胃癌組織及配對的癌旁組織(距離癌組織邊緣>5 cm)各15例。其中男10例,女5例;年齡39～71歲,平均(54.90±7.10)歲。納入標準:(1)病理學證實為胃癌;(2)術前未接受放化療;(3)臨床資料完整。排除標準:(1)合并其他部位腫瘤;(2)嚴重心肝腎功能異常;(3)免疫或代謝性疾病。

1.2 細胞與主要試劑 胃癌細胞系(AGS、NCI-N87、MGC803、BGC8231)和正常胃黏膜細胞系(GES-1)(上海冠導生物工程有限公司);人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC;上海晶諾生物科技有限公司);DMEM培養基、RPMI-1640培養基、Lipofectamine2000轉染試劑(上海佰舜泰生物科技有限公司);兔抗人多克隆抗體RTN 4B、兔抗人單克隆抗體低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)、兔抗人多克隆抗體血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、兔抗人多克隆抗體GAPDH均購于英國Abcam公司;RTN 4B干擾質粒(RTN 4B siRNA)、RTN 4B過表達質粒(pcDNA3.1-RTN 4B)(上海吉瑪制藥技術有限公司);反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、凝膠快速制備試劑盒、免疫組化試劑盒(上海信裕生物科技有限公司);Matrix 基質膠(美國BD)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色法檢測胃癌組織及癌旁組織RTN 4B表達 標本經過脫蠟、水化處理,加入3%過氧化氫,去除內源性過氧化物酶,隨后用檸檬酸修復液進行抗原修復。加入兔抗人多克隆抗體RTN 4B(1∶500),4 ℃孵育過夜,加入生物素標記的二抗,37 ℃孵育30 min。用DAB顯色、蘇木精復染、脫水、封片,顯微鏡下觀察染色情況。

1.3.2 評分及標準 染色評分=染色強度評分×陽性細胞百分比評分。染色強度評分:陰性為0分,低表達為1分,中度表達2分,高表達3分;陽性細胞百分比評分:0%～5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分。染色評分0～4分為低表達,5～12分為高表達[8]。

1.3.3 CD34標記的血管微密度(micro vessel density,MVD)檢測 在低倍鏡(×100)下觀察血管密度最高處,隨后高倍鏡(×200)下觀察計數血管[9]。以任何1個棕色染色的內皮細胞作為1個血管,管腔直徑>8個紅細胞和帶有肌層的血管不予計數。隨機取5個視野,觀察微血管數,取平均數作為MVD值。

1.3.4 細胞培養及轉染 取對數生長期胃癌細胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板,用Lipofectamine 2000轉染試劑分別將RTN 4B siRNA質粒(RTN 4B-siRNA組)和陰性對照質粒(CON組)轉入AGS細胞,分別將RTN 4B過表達質粒(pcDNA3.1-RTN 4B組)和陰性對照質粒(pcDNA3.1-CON組)轉入NCI-N87細胞,操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測RTN 4B mRNA表達 收集胃癌細胞,用Trizol試劑提取總RNA。用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,以cDNA為模板進行PCR實驗。反應條件為:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s、60 ℃退火延伸31 s,合計40個循環。以GAPDH作為內參,用2-ΔΔCt法計算RTN 4B表達水平。RTN 4B引物序列:上游5′-CGATAACTTGATGACC CCAGAA-3′;下游5′-ATAACGGCAAGATTCCATTTC-3′。GAPDH引物序列:上游5′-CGAT ACAGAGAAGATTAGCATGGC-3′;下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.6 Western-blot檢測RTN 4B、HIF-1α、VEGF蛋白表達 收集胃癌細胞,加入蛋白裂解液提取蛋白。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,加入蛋白20 μg/孔,用10%SDS-PAGE分離蛋白,隨后將蛋白轉至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入RTN 4B抗體(1∶500)、HIF-1α抗體(1∶1000)、VEGF抗體(1∶500)或GAPDH抗體(1∶5000),4 ℃反應過夜。次日加入二抗,室溫下反應1.5 h。用ECL發光儀成像,Image J軟件分析灰度值。

1.3.7 血管生成實驗 收集胃癌細胞,當細胞融合70 %時將RPMI-1640培養基換為DMEM培養基,培養48 h。收集胃癌細胞培養上清液,用0.22 μm濾器過濾。將HUVEC細胞用胃癌細胞培養上清液和新鮮培養基1∶1混合培養,當細胞融合度達80%時,用0.25 %胰酶消化。隨后將細胞懸液接種于加有Matrigel基質膠的24孔板中。37 ℃、5% CO2條件下培養12 h。顯微鏡下觀察細胞成像情況,隨機取5個視野,對管長度和節點進行定量分析[10]。

2 結 果

2.1 RTN 4B在胃癌組織中的表達及其與MVD關系 免疫組化檢測結果顯示,癌組織RTN 4B高表達率為73.33%(11/15),高于癌旁組織[13.33%(2/15)];癌組織MVD高于癌旁組織[(28.06±3.05)vs.(21.70±5.26)],差異均有統計學意義(P<0.05,圖1)。在癌組織中,高表達RTN 4B組織的MVD為(30.25±6.16),高于低表達組織(25.71±9.25),差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 胃癌組織免疫組化(×200)

2.2 RTN 4B在不同胃癌細胞株中的表達 胃癌細胞系(AGS、NCI-N87、MGC803、BGC8231)的RTN 4B基因及蛋白表達水平均高于正常胃黏膜細胞系(GES-1),差異有統計學意義(P<0.05,表1)。胃癌細胞系中AGS細胞的RTN 4B表達水平最高,而NCI-N87細胞最低(圖2)。

表1 不同細胞株內質網膜蛋白4B表達水平比較

圖2 Western-blot檢測胃癌細胞系和正常胃黏膜細胞系內質網膜蛋白4B表達水平

2.3 過表達RTN 4B對NCI-N87細胞血管生成及相關蛋白表達的影響 pcDNA3.1-RTN 4B組RTN 4B基因和蛋白表達水平均高于pcDNA3.1-CON組(P<0.05,表2)。血管生成實驗結果顯示,pcDNA3.1-RTN 4B組管長度和節點均高于pcDNA3.1-CON組(P<0.05,圖3)。

2.4 沉默RTN 4B對AGS細胞血管生成及相關蛋白表達的影響 RTN 4B-siRNA組RTN 4B基因和蛋白表達水平均低于CON組(P<0.05,表3)。血管生成實驗結果顯示,RTN 4B-siRNA組的管長度和節點高于CON組(P<0.05)。RTN 4B-siRNA組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平均低于CON組(P<0.05,圖4)。

圖3 過表達RTN 4B對NCI-N87細胞血管生成及相關蛋白表達的影響

表2 過表達RTN4B對胃癌細胞血管生成及相關蛋白的影響

表3 沉默RTN4B對胃癌細胞血管生成及相關蛋白的影響

圖4 沉默RTN 4B對AGS細胞血管生成及相關蛋白表達的影響

3 討 論

在胃癌中,新生血管會促進腫瘤侵襲和轉移,干預腫瘤血管生成會抑制腫瘤進展[11,12]。尋找腫瘤血管生成的生物學機制對胃癌的治療有重要意義。本研究發現,RTN 4B在胃癌中高表達,能夠促進胃癌血管生成,可能成為治療靶點。

有研究發現,RTN 4B參與腫瘤發生發展[13]。RTN 4B通過RhoA-SRF-MRTFA通路促進鼻咽癌細胞侵襲和遷移[14]。Nogo-B與c-FLIP相互作用,通過抑制凋亡而促進結直腸癌細胞增殖和侵襲[5]。本研究發現,RTN 4B在胃癌組織和胃癌細胞系中表達水平升高,提示RTN 4B參與胃癌發生。然而RTN 4B參與胃癌進展的機制既往未見報道。腫瘤血管生成是腫瘤進展的重要原因,而此過程較為復雜,涉及內皮基質降解、內皮細胞增殖和形成新基底膜等[15-17]。Zheng等[4]發現,RTN 4B通過激活Notch1通路促進心肌梗死后的血管生成。在肝癌的研究中,RTN 4B可通過促進腫瘤血管生成而參與癌癥進展[6]。CD34主要表達在血管內皮細胞[18],本研究檢測CD34標記的血管微密度,結果發現胃癌組織MVD高于癌旁組織,差異有統計學意義。并且在癌組織中,高表達RTN 4B組織的MVD高于低表達組織,結果說明RTN 4B能夠促進血管生成。

為進一步證實RTN 4B對胃癌血管生成的作用,本研究用Lipofectamine2000轉染試劑分別將RTN 4B siRNA質粒和陰性對照質粒轉入AGS細胞,分別將RTN 4B過表達質粒和陰性對照質粒轉入NCI-N87細胞。結果顯示,過表達RTN 4B促進胃癌血管生成,而沉默RTN 4B抑制血管生成。在低氧條件下,HIF-1α表達水平升高,進一步促進血管生成因子表達,進而參與腫瘤血管生成[19-21]。研究發現,上調RTN 4B促進HIF-1α表達,進而參與肝癌進展[22]。HIF-1α在促進血管生成的過程中,VEGF是關鍵細胞因子。VEGF促進腫瘤細胞增殖和侵襲,并可調節血管通透性[23-25]。本研究結果發現,過表達RTN 4B促進HIF-1α、VEGF表達,而沉默RTN 4B抑制HIF-1α、VEGF表達,進一步說明RTN 4B影響血管生成。

綜上,RTN 4B在胃癌組織中高表達,并且能夠促進胃癌血管生成。但本研究存在一些局限性,如未對胃癌患者進行隨訪,沒有分析RTN 4B與生存預后的關系;未分析RTN 4B與胃癌細胞增殖、侵襲、凋亡等生物學行為的關系。未來需要開展臨床及基礎研究,進一步探討RTN 4B在胃癌發生發展中的作用機制。