大黃酚通過核因子E2相關因子2/血紅素氧合酶-1信號通路對糖尿病足潰瘍大鼠新生血管生成及氧化應激的影響

黎珊珊,區島良,張 梅,謝桃梅

(儋州市人民醫院內分泌科,海南 儋州 571700)

隨著糖尿病病情的惡化,部分患者會出現糖尿病足潰瘍,即足部出現較嚴重的感染、潰爛等現象,嚴重時可導致患者殘疾,對患者的生活質量造成負面影響[1]。糖尿病足潰瘍發病機制復雜且易反復發作,持續高血糖狀態、周圍神經病變、炎癥反應及氧化應激等因素造成的血管損傷均可導致創面愈合失敗[2]。核因子E2相關因子2/血紅素氧合酶-1(Nuclear factor E2 related factor 2/heme oxygenase-1,Nrf2/HO-1)信號通路是調控機體抗氧化能力的重要通路,多項研究[3-4]表明該通路的激活對糖尿病相關疾病具有一定的保護作用。抑制Nrf2/HO-1信號通路可延緩血管生成,損害糖尿病足潰瘍的傷口愈合[5]。大黃酚是從中藥大黃中分離出的一種蒽醌類活性成分,可以緩解糖尿病的進展。據報道[6-7],大黃酚可以減輕糖尿病引起的心肌損傷及腎損傷。然而,大黃酚在糖尿病足潰瘍中的作用尚不清楚。最近的研究[8]顯示,生肌化瘀方可促進膠原蛋白再生和表皮修復,有效加速糖尿病潰瘍創面愈合,而大黃酚是其治療糖尿病潰瘍的主要藥效成分之一。此外,有報道[9]顯示,大黃酚的抗氧化、抗炎等活性受Nrf2表達的調節,大黃酚可通過激活Nrf2減輕氧化損傷和炎癥反應,改善高脂肪飲食引起的糖尿病小鼠心臟損傷。因此,本研究基于Nrf2/HO-1信號通路探究大黃酚對糖尿病足潰瘍大鼠新生血管生成及氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠(武漢貝賽模式生物科技有限公司),SPF級,9～10周齡,體重339～358 g,生產許可證號為SCXK(鄂)2022-0009。所有大鼠飼養于25 ℃左右的動物房中,自由飲食及飲水,按時清潔鼠籠及飲水瓶。本研究經醫院倫理委員會批準同意。

1.2 主要試劑 大黃酚(純度≥98.96%,批號:B20238)購自上海源葉生物科技有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)、Nrf2抑制劑ML385、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、蛋白提取試劑盒(批號:S10589、S02985、S18490、S28594、S21419)購自廣西隆華生物技術股份有限公司;血管內皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管性血友病因子(vWF)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒、HE染色試劑盒、BCA試劑盒(批號:XQ21055、XQ18544、XQ11590、XQ10499、XQ26770、XQ47889)購自湖北逸摯誠生物科技公司;兔源Nrf2、HO-1、GAPDH一抗、羊抗兔二抗(批號:JY18444、JY02859、JY29115、JY14495)購自長春西諾生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥:參照文獻[10]構建糖尿病足潰瘍大鼠模型,SD大鼠用高糖高脂飼料喂養28 d,禁食不禁水12 h后一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg)。在注射STZ第7天,大鼠空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L表示糖尿病大鼠模型構建成功,成功造模48只。隨即麻醉所有大鼠,除去大鼠后側兩足背部毛發,消毒后用釹鐵硼磁鐵做直徑為0.5 cm的圓形全層皮膚組織缺失,觀察到大鼠足部傷口有少量滲血及明顯滲出液,呈現暗紅色表明糖尿病足潰瘍大鼠模型構建成功。將造模成功的48只大鼠隨機分為模型組、大黃酚組、ML385組、大黃酚+ML385組,每組12只。另取12只大鼠作為對照組,喂養普通飼料28 d,禁食不禁水12 h后用等量0.9%氯化鈉溶液代替STZ進行腹腔注射,注射后第7天用上述方法構建直徑0.5 cm的圓形全層皮膚組織缺失。建模完成后,大黃酚組大鼠給予30 mg/kg大黃酚[11]灌胃給藥(將大黃酚和0.9%氯化鈉溶液混溶成濃度為3 mg/ml的混懸液,灌胃體積10 ml/kg),同時腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg;ML385組大鼠給予30 mg/kg ML385[12]腹腔注射給藥(將ML385和0.9%氯化鈉溶液混溶成濃度為3 mg/ml的溶液,注射體積10 ml/kg),同時灌胃0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg;大黃酚+ML385組大鼠灌胃30 mg/kg大黃酚和腹腔注射30 mg/kg ML385;對照組和模型組大鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液(灌胃和腹腔注射)。各組給藥1次/d,連續4周。在給藥期間所有大鼠均以原來的飼養方式喂養。

1.3.2 創面愈合率檢測:末次給藥結束后24 h,在大鼠創面處貼網格透明膜,采用掃描儀進行掃描,用Adobe Photoshop CS6軟件計算創面面積。創面愈合率=[1-(末次給藥結束后24 h創面面積/造模結束后創面面積)]×100%。

1.3.3 新生血管生成相關指標測定及創面組織病理學觀察:大鼠腹主動脈取血(約4 ml),4 ℃條件下以5700 r/min離心15 min,取血清,用VEGF、TNF-α ELISA試劑盒測定血清中VEGF、TNF-α水平。采集各組大鼠右后足創面組織,取部分研磨勻漿,4 ℃下以9700 r/min離心14 min,取上清,通過bFGF、vWF ELISA試劑盒測定上清液中bFGF、vWF水平。另一部分創面組織固定于4%多聚甲醛溶液,石蠟包埋,切片(4 μm),HE染色,顯微鏡觀察。

1.3.4 創面組織氧化應激相關指標檢測:采集各組大鼠左后足創面組織,分為兩部分。一部分置于-80 ℃環境中保存。另一部分使用0.9%氯化鈉溶液制成組織勻漿,4 ℃下9700 r/min離心10 min,取上清,根據MDA、SOD試劑盒的要求,測定上清液中MDA、SOD水平。

1.3.5 創面組織Nrf2/HO-1通路蛋白表達檢測:取1.3.4中剩余大鼠創面組織,勻漿后提取其中總蛋白質。定量蛋白濃度后,經加熱變性,取同質量的各組待測蛋白進行電泳分離實驗,將蛋白進行轉膜、封閉處理,加入稀釋比為1∶1200的兔源Nrf2、HO-1、GAPDH一抗,4 ℃環境中孵育過夜。用TBST洗滌后加入稀釋比為1∶2100的羊抗兔二抗溶液,室溫孵育2 h,經過顯色后置于凝膠成像儀中拍照,Image J軟件分析條帶灰度值并計算Nrf2、HO-1蛋白表達(以GAPDH 為內參)。

2 結 果

2.1 各組大鼠創面愈合率比較 見表1。與對照組比較,模型組創面愈合率降低(P<0.05)。與模型組比較,大黃酚組創面愈合率升高,ML385組大鼠創面愈合率降低(均P<0.05)。與大黃酚組比較,大黃酚+ML385組創面愈合率降低(P<0.05)。與ML385組比較,大黃酚+ML385組大鼠創面愈合率升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠創面愈合率比較(%)

2.2 各組大鼠創面組織病理形態比較 見圖1。對照組大鼠創面組織中炎性細胞較少,成纖維細胞較多,可見豐富的毛細血管。與對照組比較,模型組大鼠創面組織中可見大量炎性細胞,新生毛細血管分布較少。與模型組比較,大黃酚組大鼠創面組織中新生毛細血管顯著增多,炎性細胞顯著減少;ML385組大鼠創面組織中新生毛細血管顯著減少,炎性細胞顯著增多。與大黃酚組比較,大黃酚+ML385組大鼠創面組織中新生毛細血管顯著減少。與ML385組比較,大黃酚+ML385組大鼠創面組織中新生毛細血管顯著增多。

注:箭頭指向為毛細血管,星號為炎性細胞

2.3 各組大鼠血清VEGF、TNF-α及創面組織bFGF、vWF水平比較 見表2。與對照組比較,模型組血清VEGF及創面組織bFGF、vWF水平降低,血清TNF-α水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,大黃酚組血清VEGF及創面組織bFGF、vWF水平升高,血清TNF-α水平降低(均P<0.05);ML385組血清VEGF及創面組織bFGF、vWF水平降低,血清TNF-α水平升高(均P<0.05)。與大黃酚組比較,大黃酚+ML385組血清VEGF及創面組織bFGF、vWF水平降低,血清TNF-α水平升高(均P<0.05)。與ML385組比較,大黃酚+ML385組血清VEGF及創面組織bFGF、vWF水平升高,血清TNF-α水平降低(均P<0.05)。

表2 各組大鼠血清VEGF、TNF-α及創面組織bFGF、vWF水平比較

2.4 各組大鼠創面組織MDA、SOD水平比較 見表3。與對照組比較,模型組創面組織MDA水平升高,SOD水平降低(均P<0.05)。與模型組比較,大黃酚組創面組織MDA水平降低,SOD水平升高(均P<0.05);ML385組創面組織MDA水平升高,SOD水平降低(均P<0.05)。與大黃酚組比較,大黃酚+ML385組創面組織MDA水平升高,SOD水平降低(均P<0.05)。與ML385組比較,大黃酚+ML385組MDA水平降低,SOD水平升高(均P<0.05)。

表3 各組大鼠創面組織MDA、SOD水平比較

2.5 各組大鼠創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較 見表4。與對照組比較,模型組創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達降低(均P<0.05)。與模型組比較,大黃酚組創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達升高,ML385組創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達降低(均P<0.05)。與大黃酚組比較,大黃酚+ML385組創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達降低(均P<0.05)。與ML385組比較,大黃酚+ML385組創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達升高(均P<0.05)。

表4 各組大鼠創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較

3 討 論

研究[13]顯示,高達20%的糖尿病患者發生傷口愈合反應受損,其中最常見的是糖尿病足潰瘍。糖尿病通過影響多種生物學機制導致傷口愈合困難,常見的原因有持續高血糖狀態、慢性炎癥、微循環障礙、氧化應激反應、神經肽信號受損等,糖尿病創傷的復雜環境常導致糖尿病足潰瘍治療困難,且截肢率較高,由成纖維細胞及新生毛細血管構成的肉芽組織在潰瘍創面愈合過程中發揮重要作用[14-15]。因此,了解糖尿病足潰瘍病因,探究促進血管新生作用的藥物對于糖尿病足潰瘍的治療具有重要意義。

在創面修復過程中,bFGF能促進膠原纖維及成纖維細胞的合成,VEGF是促血管生成因子[16],vWF是血管內皮損傷標志物,可促進新生血管的生成[17]。STZ具有毒性小、成模穩定且速度快等優點,是誘導糖尿病大鼠模型常用的方法。本研究通過此方法構建糖尿病大鼠模型,采用釹鐵硼磁鐵做直徑為0.5 cm的圓形足部全層皮膚組織缺失構建糖尿病足潰瘍大鼠模型。結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠創面組織中可見大量炎性細胞,新生毛細血管分布較少,創面愈合率、血清VEGF以及創面組織bFGF、vWF、SOD水平降低,血清TNF-α及創面組織MDA水平升高,表明糖尿病足潰瘍大鼠新生血管生成緩慢,同時伴隨炎癥反應和氧化應激。給予大黃酚干預后,模型大鼠新生毛細血管增多,炎性細胞減少,創面愈合率、血清VEGF以及創面組織bFGF、vWF、SOD水平均升高,血清TNF-α及創面組織MDA水平降低,表明大黃酚具有促進糖尿病足潰瘍大鼠新生血管生成以及抑制炎癥反應和氧化應激的作用。

研究[18]顯示糖尿病患者持續高血糖、慢性炎癥反應、氧化應激增加均與病情惡化密切相關。Nrf2可使細胞免受氧化應激損傷并促進HO-1等抗氧化蛋白的表達,該通路的激活時具有抑制機體炎癥反應、清除自由基、提高抗氧化能力等作用[19]。研究[5,20]表明Nrf2/HO-1通路與糖尿病腎病、糖尿病足潰瘍等疾病聯系密切,激活Nrf2/HO-1通路可減輕氧化應激及機體TNF-α等炎癥因子的釋放,減輕糖尿病腎病大鼠的腎臟損傷,并可促進血管生成,減輕糖尿病足潰瘍。本研究中,大黃酚組創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達較模型組升高;而大黃酚+ML385組大鼠創面組織Nrf2、HO-1蛋白表達較大黃酚組降低,較ML385組升高。提示大黃酚對糖尿病足潰瘍大鼠創面組織新生血管生成的促進作用以及對炎癥反應和氧化應激的抑制作用可能是通過Nrf2/HO-1信號通路的激活進行的。

綜上所述,大黃酚能促進糖尿病足潰瘍大鼠新生血管的生成,抑制炎癥反應和氧化應激,其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關。但糖尿病足潰瘍發病機制復雜,本研究只是初步探究其可能機制,關于大黃酚是否通過其他途徑發揮作用尚不清晰,仍需進一步探究。