內嗎啡肽2對神經病理性痛大鼠背根神經節內μ-阿片受體表達的影響

謝雨杉,劉海帆,孫 騊,萬法萍

神經病理性痛(neuropathic pain,NP)是神經系統原發性損傷或功能障礙所引起的疼痛,阿片類藥物對NP的治療效果不理想[1]。研究[1]表明,背根神經節(dorsal root ganglion,DRG)中μ-阿片受體(μ-opioid receptor,MOR)表達下調是阿片類藥物療效不佳的主要原因之一。MOR屬于G蛋白偶聯受體,與配體結合后,發生受體內化和脫敏現象[1]。研究[2]表明,Rab7是胞內運輸的關鍵調控因子,與疼痛狀態下的MOR表達量降低有關。

內嗎啡肽-2(endomorphin-2,EM2)是MOR的內源性激動劑,參與病理性痛的形成[3]和鎮痛過程[4]。研究[5]表明,EM2可誘導MOR羧基末端第375位絲氨酸(Ser375)發生快速磷酸化,此過程在其復敏中發揮重要作用。糖尿病性痛大鼠脊髓中,EM2不僅增加了磷酸化MOR的表達量,還促進MOR的表達[3],提示在鎮痛過程中,EM2可促進MOR的功能恢復。因此,該研究以NP模型為研究對象,初步探討在EM2介導的鎮痛過程中,大鼠DRG內MOR的表達變化及胞內囊泡轉運對其表達的影響,以加深對內源性鎮痛系統功能的理解。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組健康成年SD大鼠,雄性,初始體質量200～220 g,由徐州醫科大學實驗動物中心提供。大鼠隨機分為正常對照組(Control組)、病理性痛組(SNI-NS組)和藥物組(SNI-EM2組),每組10只。動物飼養和實驗操作均符合徐州醫科大學動物倫理委員會的要求和規定(倫理號:202208S027)。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1主要儀器 Von Frey纖維絲購自美國Stoelting公司,PE-10導管(i.d. 0.28 mm,o.d. 0.64 mm)購自美國Scientific Industries公司,熒光共聚焦顯微鏡(型號:STELLARIS 5)購自日本Olympus公司,微量進樣針購自上海高鴿工貿有限公司。

1.2.2主要試劑 MOR抗體(貨號:ab17394,ab10275)、Rab7抗體(貨號:ab137029)購自美國Abcam公司,Ser375MOR抗體(貨號:CSB-PA168551)購自武漢華美生物工程有限公司,actin抗體(貨號:20536-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司,山羊抗兔IRDye 800CW二抗(貨號:V926-32211)購自徐州微科曼得生物工程有限公司,溶酶體相關膜蛋白1(lysosome-associated membrane proteins 1,LAMP1)抗體(貨號:bs-1970R)購自北京博奧森生物技術有限公司,Alexa488驢抗豚鼠IgG(貨號:706-545-148)購自美國Jackson公司,Alexa594驢抗兔IgG(貨號:#8889)購自美國Cell Signaling Technology公司,EM2(貨號:GC10059)購自美國GlpBio公司。

1.3 方法

1.3.1病理性痛模型的制備 該研究參照Decosterd et al[6]的方法,制備坐骨神經分支選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)誘導的NP模型。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后,切開左側大腿背側皮膚,鈍性分離股二頭肌,暴露坐骨神經及其3個分支:脛神經、腓總神經和腓腸神經,雙重結扎并離斷脛神經和腓總神經,保留并避免牽拉腓腸神經,逐層縫合手術切口。術后對切口進行常規消毒抗炎處理直至愈合。

1.3.2后足縮足反應閾值(paw withdrawal threshold,PWT)的測定 測試前3天,將大鼠放入行為學測試平臺適應環境,每天1 h。手術當天、術后1、3、5、7 d以及給藥后1、3、5、7、9 d使用校準的不同強度的Von Frey纖維絲測定大鼠的PWT值。測定時,待大鼠安靜后,從最低刺激強度開始,用纖維絲垂直刺激大鼠足底外側皮膚,持續3～5 s,當大鼠出現抬足、舔足或躲避等行為視為陽性反應。每個刺激強度重復測試5次,相鄰兩次刺激時間間隔5 min以上,以能引起3次以上陽性反應的最低刺激強度作為PWT值。

1.3.3鞘內置管和給藥 大鼠麻醉后,以兩側髂前上棘連線中點為中心,沿脊柱兩側作縱向切口,鈍性分離肌肉,暴露并去除第6腰椎棘突,將PE-10導管由腰5與腰6棘突間隙刺入蛛網膜下隙并向頭端推入約2 cm,置管過程中可見導管內有清亮的腦脊液流出。固定導管,依次縫合肌肉和皮膚。置管術后的大鼠需分籠單獨飼養。

鞘內給藥時用微量注射器將5 μl藥液或無菌生理鹽水緩慢推入PE-10導管內,推注結束后再推入10 μl無菌生理鹽水,使藥物充分注射至蛛網膜下隙。推入過程以使大鼠一直保持安靜狀態為宜。

1.3.4Western blot實驗 大鼠麻醉后,迅速取出腰4～6節段的DRG。提取蛋白后,采用BCA法檢測上清液中的蛋白濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉30 min后,將PVDF膜置于一抗中:MOR抗體(1 ∶1 000)、Rab7抗體(1 ∶1 000)、Ser375MOR抗體(1 ∶1 000)或actin抗體(1 ∶1 000),4 ℃搖床過夜。TBST漂洗3次,每次10 min。滴加相應的二抗(1 ∶15 000),搖床上避光反應2 h后,TBST漂洗3次,每次10 min。使用雙紅外激光成像系統掃描成像。

1.3.5免疫熒光組織化學染色 大鼠麻醉后,經左心室、升主動脈灌注200 ml生理鹽水后,灌注400 ml 4%多聚甲醛溶液,取腰4～6節段DRG后固定24 h,經30%蔗糖溶液脫水后行冰凍切片。10% FBS室溫封閉30 min后,滴加一抗:MOR抗體(1 ∶500)、Rab7抗體(1 ∶200)或LAMP1抗體(1 ∶200),4 ℃孵育48 h,0.1 mol/L PBS漂洗3次,每次10 min。滴加二抗:Alexa488驢抗豚鼠IgG(1 ∶500)和Alexa594驢抗兔IgG(1 ∶500),室溫避光孵育4 h,0.1 mol/L PBS漂洗3次,每次10 min,熒光封片劑封片后,熒光共聚焦顯微鏡拍照采集圖像。

2 結果

2.1 SNI對大鼠PWT值的影響坐骨神經分支選擇性損傷誘導的NP模型,可產生持久的機械痛行為學表現,是研究NP常用的模型之一。該實驗SNI模型大鼠在術后第3天術側PWT值與正常對照組比較明顯降低(分組,F=430.8,P<0.01),術后第7天降低至最低水平,且至少持續至術后第21天。手術對側的PWT值與正常對照組比較差異無統計學意義(圖1)。

圖1 SNI模型大鼠后足PWT的測定(n=6)

2.2 EM2的鎮痛作用該實驗使用SNI術后7 d的NP大鼠,鞘內注射不同劑量(1、5、10、20、40 μg)的EM2,給藥后每隔10 min測定大鼠術側后足PWT值,研究EM2作用的時程和量效變化。結果顯示,鞘內注射1、5、10 μg的EM2對SNI的NP大鼠未產生明顯的鎮痛作用,20和40 μg EM2的鎮痛效果和時程變化相似,即EM2給藥10 min后的鎮痛效應最顯著(時間,F=88.44,P<0.01),給藥20 min后藥效降低,給藥30 min后,EM2的鎮痛效應消失,大鼠PWT值恢復至給藥前水平(圖2)。選擇達到鎮痛效應的最小劑量作為多次給藥劑量,該實驗EM2長期給藥劑量為20 μg。

圖2 鞘內注射EM2對SNI的NP大鼠鎮痛作用的時程和量效變化

病理性痛組和藥物組大鼠于術后第7天開始進行鞘內注射,每天1次,連續10 d,每隔1天于注射結束10 min后測定大鼠的PWT值。與注射前比較,鞘內注射生理鹽水對NP大鼠PWT值沒有明顯的影響。與病理性痛組比較,鞘內注射EM2后,大鼠的PWT值明顯升高(分組,F=376.8,P<0.01),連續給藥10 d,EM2仍可有效緩解SNI的NP,且多次鞘內注射EM2,未見明顯的鎮痛效果降低現象(表1和圖3)。

表1 三組大鼠后足縮足反應閾值比較

圖3 EM2對SNI的NP大鼠后足PWT值的影響

2.3 EM2對SNI的NP大鼠DRG內MOR表達的影響免疫熒光染色結果顯示,MOR免疫陽性產物主要分布于DRG的中、小直徑神經元胞體和部分神經纖維中(圖4A)。NP后,大鼠DRG內MOR陽性細胞數量明顯降低(F=26.19,P<0.001)(圖4A、B),鞘內注射EM2后,MOR陽性細胞數量明顯升高(F=26.19,P<0.001),Western blot結果與形態學結果變化相似,與正常對照組比較,病理性痛組大鼠DRG內MOR的表達量下降(F=7.749,P<0.05)(圖4C、D),藥物組大鼠DRG內MOR蛋白的表達量升高(F=7.749,P<0.05)(圖4C、D)。該實驗進一步檢測MOR磷酸化表達量的變化,結果顯示,病理性痛組大鼠DRG內Ser375MOR蛋白的表達量較正常對照組降低(F=9.679,P<0.05),藥物組大鼠DRG內Ser375MOR蛋白的表達量較病理性痛組升高(F=9.679,P<0.05)(圖4E、F)。

圖4 EM2對SNI的NP大鼠DRG內MOR表達的影響

2.4 胞內轉運機制對EM2鎮痛過程中的MOR表達變化的影響該實驗使用免疫熒光單標染色和Western blot方法,研究了正常對照組、病理性痛組及藥物組大鼠DRG內Rab7的表達變化。結果顯示,與正常對照組比較,病理性痛組中Rab7的表達量明顯增高(FIF=22.67,P<0.05;FWestern blot=12.19,P<0.01)。鞘內注射EM2后,藥物組中的Rab7的表達量較病理性痛組降低(FIF=22.67,P<0.01;FWestern blot=12.19,P<0.05)(圖5)。進一步對3組大鼠DRG神經元進行MOR與Rab7免疫熒光雙重標記染色。結果顯示:SNI的NP大鼠DRG內MOR/Rab7免疫雙標陽性產物占Rab7陽性標志物或MOR陽性標志物的比例較正常對照組均明顯升高(FRab7=10.76,P<0.01;FMOR=5.08,P<0.05),當給予EM2處理后,MOR/Rab7免疫雙標陽性產物占Rab7陽性標志物或MOR陽性標志物的比例較病理性痛組均明顯降低(FRab7=10.76,P<0.05;FMOR=5.08,P<0.05)(圖6)。

圖5 EM2對SNI的NP大鼠DRG內Rab7表達的影響

圖6 免疫熒光雙標染色檢測MOR與Rab7雙標陽性產物

溶酶體相關膜蛋白1 (lysosomal associated membrane protein 1,LAMP1)分布于自噬細胞器和內溶酶體細胞器,可作為溶酶體標志物。免疫熒光雙標染色結果顯示:與正常對照組比較,病理性痛組大鼠DRG內MOR/LAMP1免疫雙標陽性產物占LAMP1或MOR免疫陽性產物的比例均增高(FLAMP1=6.215,P<0.05;FMOR=7.681,P<0.01)。鞘內注射EM2后,與病理性痛組比較,藥物組大鼠DRG內MOR/LAMP1免疫雙標陽性產物占LAMP1或MOR免疫陽性產物的比例均明顯降低(FLAMP1=6.215,P<0.05;FMOR=7.681,P<0.05)(圖7)。

3 討論

DRG是外周感覺性信息傳遞至中樞的第一站。DRG神經元內的MOR,是內源性阿片系統的重要組成部分,也是臨床上阿片類藥物作用的主要受體。既往研究[7]表明,在阿片類藥物治療效果欠佳的NP和糖尿病NP等動物模型DRG神經元內MOR的表達量降低,但是在阿片類物質鎮痛效果較好的炎性痛模型中,脊髓背角和DRG神經元內MOR的表達量增加,提示MOR的表達量與阿片類藥物的鎮痛療效密切相關。

作為MOR的天然的內源性配體,EM2能有效緩解炎性痛、癌性痛和NP[8],尤其對傳統鎮痛藥物不敏感的糖尿病NP具有較好的鎮痛效果[3]。該實驗顯示多次注射EM2未見明顯的藥效降低。Wu et al[9]研究顯示,鞘內注射攜帶EM2的重組腺病毒對SNI的NP具有較好的鎮痛效應,且沒有成癮和耐受等副作用,以上結果與該研究結果一致,但是作者未研究DRG或脊髓中MOR的表達與EM2介導的鎮痛效應之間的關系。體外研究顯示,EM2可對人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y[10]和人乳腺癌細胞MCF7[11]中MOR的mRNA表達產生正向和負向的調節作用,推測這種調節的差異性是由于EM2對不同亞型腺苷酸環化酶活性的作用不同,抑制或促進cAMP表達,從而對基因轉錄水平產生不同影響。然而文中未探究EM2介導的MOR蛋白表達變化。研究[12]表明,在炎癥、神經病變或骨損傷等病理狀態下,外周阿片受體的數量增加是阿片類藥物鎮痛作用增強的原因之一。該實驗在體研究中顯示,藥物組DRG內MOR的表達量明顯升高,提示MOR的表達增加可能是EM2多次注射未見明顯藥效降低的原因。

MOR蛋白結構內大約有20個潛在的磷酸化位點有助于受體脫敏和胞吞作用。研究[13]顯示,EM2對MOR具有高親和力,其與MOR結合后,可使Ser375MOR發生快速磷酸化[14]。該實驗連續鞘內注射EM2明顯增加SNI大鼠DRG內Ser375MOR蛋白的含量,與上述結果一致。磷酸化后的受體與β-抑制蛋白2(β-arrestin 2)結合,形成MOR-β-arrestin 2復合體內吞進入胞內。Rab蛋白是一類小分子調節蛋白,廣泛存在于細胞質膜和細胞器膜中,其中Rab7是將內吞囊泡運輸至晚期溶酶體的關鍵調節蛋白,可作為受體降解失活的指標[15]。該研究表明,SNI的NP大鼠DRG內Rab7的表達增加,且MOR/Rab7和MOR/LAMP1免疫熒光雙標產物占Rab7陽性標志物或LAMP1陽性標志物的比例增高。提示SNI的NP后DRG內Rab7表達上調,MOR進入溶酶體發生降解,導致受體數量減少。這與Mousa et al[2]在糖尿病NP大鼠DRG的觀察的結果一致。鞘內注射EM2后,藥物組大鼠DRG內Rab7的表達較病理性痛組降低,MOR/Rab7和MOR/LAMP1免疫熒光雙標產物占Rab7陽性標志物或LAMP1陽性標志物的比例降低。提示EM2作用后,內吞的受體囊泡進入溶酶體降解途徑減少,這可能是藥物組大鼠DRG神經元中MOR表達增加的原因之一。

神經-免疫-內分泌環路是存在于動物和人體內重要的調節網絡,維持機體穩態平衡。神經生長因子(nerve growth factor,NGF)是神經元的營養物質,由外周組織合成,逆行運輸至脊髓和DRG的神經元中。外周神經損傷可阻斷NGF的運輸,從而降低其在脊髓和DRG神經元中的表達。EM2作為內源性阿片肽,除了發揮鎮痛作用,在神經系統的保護和分化過程中均發揮著重要的作用。阿片肽可促進NGF的表達[16]。外源性NGF可增加初級神經元MOR的表達[17],而Mousa et al[2]在糖尿病性痛大鼠DRG內顯示NGF可以抑制胞內Rab7的表達,由此推測,SNI的NP狀態下,神經體液因素可能也參與了EM2與MOR結合后的受體胞內轉運過程。