基于腦-腸軸探討電針與雙歧桿菌對單純性肥胖大鼠腸源性信號物質及脂代謝的影響

頡媛媛,錢虹宇,謝順鎧,許 婧

肥胖病是由于體內攝入大于消耗,造成脂肪堆積和(或)分布異常,進而導致體質量增加的慢性疾病,是造成2型糖尿病和各種心血管疾病發生的危險因素[1]。至2016年,全球18歲以上(含18歲)的人群接近20億人超重,且其中約1/3系肥胖[2]。目前針對肥胖的療法多樣,但療效存在參差,而針灸治療肥胖療效確切,安全性高,專家推薦意見為A(證據極有效)[3]。

中醫理論強調整體觀,以藏象理論為基礎,認為腦腸二者之間在生理及病理方面密切相關[4]。腦-腸軸是中樞系統和胃腸道系統構成的雙向信號傳導系統[5]。中樞神經系統是腦-腸軸負反饋調節的核心,整合并向外周組織發出腦部及胃腸道傳達的信號胃腸道系統接收信號,共同調節能量平衡從而達到控制體質量的目的[6]。該實驗研究通過對比電針與雙歧桿菌對單純性肥胖大鼠生存狀態、腸源性信號物質[腸嗜鉻細胞(enterochromaffin cell,ECC)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、組胺(histamine,HIS)]水平、血脂[三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)]水平等的影響,驗證電針療法的優效性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物購入體質量在40～60 g范圍內的4周齡SPF級SD大鼠60只(雌雄各半)。實驗動物均來自于成都達碩實驗動物有限公司,喂養條件為12 h明暗交替,室溫22～25 ℃,濕度40%～70%。動物購入后適應性喂養1周,期間飼以基礎飼料,自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器ELISA試劑盒購自武漢Elabscience公司;六胺銀染液套裝購自武漢Servicebio公司;生化試劑盒購自深圳Mindray公司;雙歧桿菌三聯活菌膠囊購自晉城海斯制藥有限公司(國藥準字S19993065);G6850-Ⅱ型電針儀購自上海華誼醫用儀器有限公司;電子天平購自上海越平科學儀器(蘇州)制造有限公司;臺式高速冷凍離心機、渦旋混合器、臺式高速微量離心機購自美國賽洛捷克公司;數顯氣浴恒溫振蕩器購自常熟朗越儀器制造有限公司;全自動生化分析儀購自深圳邁瑞醫療器械有限公司。

1.3 模型制備及分組

1.3.1模型制備 適應性喂養結束后,按照隨機原則,將大鼠按1～60編號,采用隨機數字法進行初次分組,其中50只為高脂組,給予高脂飼料(配方:每200 g普通大鼠飼料中添加豬油50 g,白糖150 g,奶粉20 g,雞蛋1個)進行喂養,其余10只為普食組,給予普通飼料(配方:水分94 g/kg、蛋白質190 g/kg、脂肪51 g/kg、粗纖維36 g/kg、灰分62 g/kg、鈣11.3 g/kg、磷8.6 g/kg),造模期間大鼠自由攝食飲水,待高脂組體質量大于普食組體質量 20%者定為單純性肥胖大鼠[7]。

1.3.2分組 飼養8周后,造模成功30只(雌雄各半),將其隨機二次分組分為模型組、電針組、雙歧桿菌組,每組10只(雌雄各半);普食組的10只(雌雄各半)作為空白組。

1.4 干預措施

1.4.1空白組 繼續飼以普通飼料,與電針組同法捆綁固定,7 g/kg生理鹽水灌胃,1次/天,6次/周。

1.4.2模型組 繼續飼以高脂飼料,與電針組同法捆綁固定,7 g/kg生理鹽水灌胃,1次/天,6次/周。

1.4.3電針組 繼續飼以高脂飼料,選取雙側天樞、豐隆,穴位定位參照《實驗針灸學》[8]的動物穴位圖譜。將該組大鼠以仰臥位固定在鼠臺上,露出其腹部與后肢。將治療穴位 2 cm×2 cm面積區域的毛發剃除干凈,并酒精棉球對電針穴位進行消毒;使用針灸針刺入皮下25 mm左右,以平補平瀉法運針約1 min后,連接電針治療儀,選用頻率為2 Hz,強度為1.5 V的連續波,觀察大鼠下肢及針柄變化,以輕微節律抽搐為度,留針30 min,7 g/kg生理鹽水灌胃1次/天,6次/周,兩側穴位交替治療。

1.4.4雙歧桿菌組 繼續飼以高脂飼料,與電針組同法捆綁固定,雙歧桿菌溶液灌胃治療。雙歧桿菌三聯活菌膠囊用生理鹽水以100 mg/ml配制,現配現用,7 g/kg灌胃[9],1次/天,6次/周。

1.5 取材及檢測

1.5.1取材 治療結束后,大鼠禁食不禁水12 h,以1%戊巴比妥鈉(30 ml/kg)予腹腔注射麻醉后,開腹收集大鼠腹主動脈血液4 ml左右,1 500 r/min 4 ℃離心15 min,使用移液槍將上層血清移至EP管中,-80 ℃保存備用;另外,迅速取出結腸組織、下丘腦組織等樣本,置于液氮中備用。

1.5.2體質量檢測 固定每周一上午9:00測量大鼠體質量、攝食量并記錄。

1.5.3ELISA檢測 5-HT、HIS等指標采用ELISA法測定。結腸、下丘腦組織標本研磨勻漿取上清液待用,提前20 min取出試劑盒和樣本,平衡至室溫;配制所需要的試劑及工作液;微孔板法測定各指標水平。

1.5.4銀染色檢測 通過對結腸組織標本石蠟切片脫蠟至水、媒染劑染色、工作液配制、組織酸化、孵育染色、顯色、六胺銀染液處理、復染、脫水封片、顯微鏡鏡檢等程序測定結腸ECC陽性細胞水平。

1.5.5生化檢測 通過對血清標本BCA定量處理之后采用生化儀對TC、TG、LDL、HDL水平進行檢測。

2 結果

2.1 各組大鼠生存狀態造模前各組大鼠活動度、毛發光澤度均較正常;造模后,除空白組外,其余各組大鼠活動度、毛發光澤度降低;治療結束后,各治療組大鼠活動度、毛發光澤度好轉。

2.2 各組大鼠體質量造模前,各組大鼠體質量差異無統計學意義;干預前,與空白組比較,其他各組大鼠體質量升高(P<0.05),模型組、電針組、雙歧桿菌組體質量比較差異無統計學意義;干預后,與空白組比較,模型組體質量升高(P<0.05);與模型組比較,電針組與雙歧桿菌組體質量明顯降低(P<0.05),差異有統計學意義,電針組較雙歧桿菌組體質量降低明顯。見表1。

表1 各組大鼠干預前后體質量

2.3 各組大鼠攝食量干預前,各組大鼠攝食量差異無統計學意義(F=1.48,P>0.05);干預后,與模型組比較,電針組與雙歧桿菌組攝食量下降,差異有統計學意義(F=89.32,P<0.05),且電針組較雙歧桿菌組攝入量下降明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠干預前后攝食量比較

2.4 各組大鼠腸源性信號物質

2.4.1各組大鼠結腸ECC陽性細胞水平 干預后,與空白組比較,模型組大鼠結腸ECC陽性細胞水平升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、雙歧桿菌組大鼠結腸ECC陽性細胞水平降低(P<0.05),且電針組較雙歧桿菌組降低明顯,差異有統計學意義。各組大鼠干預后結腸ECC陽性細胞水平方差分析F=366.35。見圖2、3。

圖2 各組大鼠干預后結腸ECC陽性細胞水平

圖3 各組大鼠結腸ECC銀染色照片 ×400

2.4.2各組大鼠結腸與下丘腦5-HT、HIS水平 干預后,與空白組比較,模型組大鼠結腸及下丘腦中5-HT、HIS升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、雙歧桿菌組大鼠結腸及下丘腦中5-HT、HIS降低(P<0.05),且電針組相關指標較雙歧桿菌組降低明顯,差異有統計學意義。各組大鼠干預后結腸和下丘腦5-HT水平方差分析F=2 933.36、807.78;結腸和下丘腦HIS水平方差分析F=826.19、103.66。皮爾遜相關性檢驗顯示結腸中ECC水平與5-HT、HIS在0.01級別(雙尾)相關性顯著,相關系數Γ值為0.85、0.98。見圖4、5。

圖4 各組大鼠干預后結腸與下丘腦5-HT水平

圖5 各組大鼠干預后結腸與下丘腦HIS水平

2.5 各組大鼠血脂水平干預后,與空白組比較,模型組大鼠血清TC、TG、LDL水平升高, HDL水平降低(P<0.05);與模型組比較,電針組血清TC、TG、LDL水平降低(P<0.05),差異有統計學意義,HDL水平雖升高,但差異無統計學意義(P>0.05),雙歧桿菌組干預后血清TC、TG水平降低(P<0.05),差異有統計學意義,LDL 、HDL水平雖有改變,但差異無統計學意義(P>0.05),且電針組較雙歧桿菌組的血脂相關指標更接近空白組。各組大鼠干預后TC、TG、LDL、HDL水平方差分析F=4.59、3.78、2.50、1.64。見圖6。

圖6 各組大鼠干預后血脂水平

3 討論

研究[10]表明電針治療高脂飲食誘導的肥胖療效確切,具有安全性高、價格低廉,患者接受度高等特點。腧穴是電針的施術部位,準確選穴是電針取效的關鍵之一。有研究[11]顯示在治療肥胖的腧穴處方配伍規律中,天樞穴和豐隆穴是針灸治療肥胖的有效腧穴配伍。天樞穴和豐隆穴均是足陽明胃經腧穴,天樞穴是大腸經的募穴,位于人體上下之氣交合處,為升清降濁之樞紐;豐隆穴是胃經的絡穴,一絡通兩經,屬陽而絡陰,二者結合使用可健脾和胃,調和腸胃,調暢中焦。雙歧桿菌是放線菌門中最主要的一種有益菌,對腸道功能甚至機體的平衡都有很大的影響,但其作為一種活性菌,不便于儲存,且長期服用可能會導致腸道產生依賴性而使機體本身的菌群失活。該實驗選擇高脂飲食誘導的肥胖大鼠模型是因其與人類肥胖類型相似,具有較高的研究價值。課題組前期研究表明針灸可以對機體的基礎代謝活動起到良性調節,加速脂肪代謝,還可抑制胃腸活動,降低食欲和營養物質的吸收,調節腸道微生物的物種豐度。該實驗研究基于腦-腸軸,以腸內分泌系統的信號中轉和傳遞為切入點,觀察顯示長期高糖高油飲食可誘導健康大鼠腸源性信號物質的變化并通過腦-腸軸向中樞遞呈,使之自下而上刺激下丘腦對機體作出反應,大鼠攝食增加,代謝減緩,發生肥胖。電針和雙歧桿菌療法均可改善因高脂飲食誘導的肥胖狀態,提高肥胖大鼠的生存水平,且電針的治療效應與雙歧桿菌相比在調整相關腸源性信號物質水平刺激下丘腦控制攝食方面優勢明顯,可加快脂代謝,減輕體質量,是治療肥胖的優勢手段。針灸治療疾病強調整體觀,其起效機制具有多層面、多環節、多靶點的特點,現代研究也表明針灸療法對肥胖患者的代謝水平、胃腸道系統等多個機體系統具有調節作用,而當前多數開展的研究切入點較散在,探索針灸治療肥胖的整體效應機制將會成為更進一步的目標,有助于為針灸治療肥胖提供有力的研究證據支持。

該實驗研究尚存在一些不足,如實驗設計時未加入假電針組進行對比研究、僅做了觀察性的研究未進行深層次的機制研究等,導致結果較局限。需要在后續工作中加以深入研究。