基于MAMs探究RVD1對衰老大鼠心肌細胞自噬與凋亡的影響

鄭 揚,黃玉冰,黃文霞,李海濤

衰老是一種常見且不可避免的自然現象。臨床資料[1]顯示,衰老過程中心臟病的易感性增加,心臟主要出現左心室肥厚、心肌纖維化增加、心功能不全等變化,并引起一系列心血管疾病[2-3]。線粒體-內質網偶聯(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes, MAMs)是內質網和線粒體外膜之間的物理連接位點,密切參與從內質網到線粒體的應激信號轉導。研究[4]表明,在衰老過程中心臟和骨骼肌中MAMs結構發生變化,其完整性遭到破壞,MAMs相關蛋白表達減少。由此推測,MAMs可能是衰老相關心肌損傷的一個關鍵靶點。

消退素D1(ResolvinD1, RVD1)是一種源自omega-3多不飽和脂肪酸的脂質介質。研究[5]表明,RVD1能夠減少血管緊張素Ⅱ引發的中性粒細胞和巨噬細胞浸潤,抑制心臟肥大、間質和血管周圍纖維化以及高血壓的發生。然而,RVD1能否在衰老中對心肌組織起到保護作用目前尚不明確。因此,該研究通過觀察RVD1對自然衰老大鼠心肌組織的影響,探討衰老所致心肌受損的相關機制,以期為衰老相關心肌損傷的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料實驗動物選用30只18月齡SD大鼠和10只6月齡SD大鼠,均為雄性,由海南藥物研究所有限責任公司提供[生產合格證號:SCXK(瓊)2020-0007]。實驗期間將大鼠飼養于SPF級飼養室[使用合格證號:SYXK(瓊)2022-0013],定期更換墊料,給予充足水源與飼料,溫度為22～24 ℃,相對濕度為45%～55%,光照/黑暗各12 h交替模擬正常晝夜。RVD1(美國ChemeGen公司,批號:CY10936,純度:98%),心肌組織β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶生物公司),Masson試劑盒與TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京百奧博萊生物公司),HE染色試劑盒、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜及電化學發光分析(electrochemiluminescence,ECL)顯影液(上海碧云天生物研究所),免疫組化S-P法試劑盒(武漢伊萊瑞特生物公司),環氧樹脂812(eponate812,Epon812)(美國Ted Pella公司),醋酸雙氧鈾與枸櫞酸鉛(北京海德創業生物公司),放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)蛋白裂解液(上海貝博生物公司),兔抗大鼠微管相關蛋白3(microtubule associated protein 3,LC3)多克隆抗體、兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗體、兔抗人p62多克隆抗體、兔抗人葡萄糖調節蛋白75(glucose-regulated proteins 75,GRP75)多克隆抗體、兔抗人電壓依賴性陰離子通道1(volt-dependent anion channel 1,VDAC1)多克隆抗體、兔抗人線粒體融合蛋白2(mitochondrial fusion protein 2,Mfn2)多克隆抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組、給藥與處理 將30只18月齡SD大鼠按數字隨機表法分為模型組、低劑量RVD1組、高劑量RVD1組,每組10只,另取10只6月齡SD大鼠作為對照組。參考文獻[6]中的給藥劑量,低劑量RVD1組和高劑量RVD1組大鼠分別尾靜脈注射50、100 ng/ml RVD1,劑量為2 μl,每日1次,對照組和模型組同時注射等量PBS,持續干預21 d。末次給藥12 h后,處死各組大鼠并快速取出心臟組織,預冷的生理鹽水洗滌后,一部分置于4%多聚甲醛中固定,另一部分置于液氮中冷凍后存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2對-硝基苯酚法測定大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性 取適量各組大鼠的心肌組織,按照組織質量(g) ∶提取液體積(ml)為1 ∶10的比例加入提取液,置于冰上裂解30 min,離心機4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,吸取上清液,使用β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒測定各組樣本內β-半乳糖苷酶活性,建立標準曲線,按照樣本蛋白濃度計算酶活性。

1.2.3HE染色檢測大鼠心肌組織病理形態學變化 將置于4%多聚甲醛固定好的各組大鼠心肌組織取出,浸入梯度乙醇中脫水,二甲苯中透明,并包埋在融化的石蠟中。將包埋好的蠟塊切成5 μm厚的組織切片,放于60 ℃烤箱烤干30 min,脫蠟水化,進行HE染色。染色結束后,滴加中性樹膠封固,室溫晾干,光學顯微鏡下觀察心肌組織變化并拍照。

1.2.4Masson染色觀察大鼠心肌組織內膠原沉積 取制備好的各組大鼠心肌組織切片,常規脫水透明,按照Masson染色試劑盒說明書步驟,加入Masson染色工作液室溫染色,浸洗干凈,滴加中性樹膠封固,室溫晾干,光學顯微鏡下觀察心肌組織膠原纖維沉積情況并拍照,鏡下藍染為膠原纖維沉積區域。Image J 軟件分析膠原纖維沉積情況,計算心肌組織膠原容積分數(collagen volume fraction,CVF),CVF=膠原藍染面積/組織總面積×100%。

1.2.5TUNEL染色檢測大鼠心肌細胞凋亡 取制備好的各組大鼠心肌組織切片,常規脫水透明,加入蛋白酶K修復,破膜處理,采用TUNEL試劑盒檢測心肌細胞凋亡,加入TUNEL工作液染色,PBS清洗后,加入DAPI染細胞核,滴加抗熒光淬滅封片劑封固,室溫晾干,置于熒光顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡情況并拍照,鏡下綠色熒光標記的細胞為TUNEL陽性,代表細胞凋亡,藍色熒光標記的為細胞核,隨機選擇6個視野計數,以TUNEL陽性細胞數目與總細胞數目之比記為TUNEL陽性細胞比例。

1.2.6免疫組化S-P法檢測大鼠心肌組織自噬標志物LC3表達 各組大鼠心肌組織切片經脫水透明后,浸入修復液中微波爐加熱原修復,3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶,破膜處理后,雙蒸水清洗切片,以山羊血清室溫封閉30 min,加入稀釋后的兔抗大鼠LC3多克隆抗體(1 ∶200),4 ℃孵育過夜。棄一抗液,PBS清洗后甩干切片,加入稀釋后的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(1 ∶200),37 ℃孵育30 min,PBS清洗,使用即用型DAB 顯色,蘇木精復染,再次脫水透明,滴加中性樹膠封固,室溫晾干,光學顯微鏡下觀察心肌組織染色情況并拍照,鏡下棕色至棕褐色染色為LC3蛋白陽性表達,Image-Pro Plus軟件分析蛋白陽性表達區域占總區域比例,記為LC3蛋白陽性率。

1.2.7透射電鏡觀察大鼠心肌組織內MAMs形成 收集的各組大鼠心肌組織用3%戊二醛固定,1%鋨酸再固定,使用梯度酒精和丙酮對樣品進行脫水,Epon812包埋,切成超薄切片,固定至銅網,進行醋酸雙氧鈾與枸櫞酸鉛染色,室溫下干燥過夜,透射電鏡下進行成像并拍照,Image-Pro Plus軟件測量線粒體-內質網偶聯與線粒體周長,分析線粒體-內質網偶聯長度占線粒體周長比例。

1.2.8Western blot法測定大鼠心肌組織自噬相關蛋白與MAMs相關蛋白表達 從-80 ℃冰箱中取出各組大鼠心肌組織樣品,加入RIPA蛋白裂解液,研磨勻漿后,冰上靜置30 min,離心機4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,取上清液即為樣本總蛋白,BCA法蛋白定量,獲得蛋白濃度。將蛋白煮沸變性,制備10%SDS-PAGE凝膠并待其凝固后,取等量30 μg蛋白加樣,電泳分離后切下目的條帶,電轉至PVDF膜。浸入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,以減少非特異性結合。加入稀釋后的各一抗(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。棄一抗液,TBST洗膜,加入稀釋后的對應二抗(1 ∶5 000),室溫孵育1 h。TBST再次洗膜,采用ECL顯影,凝膠成像顯影儀中成像并保存圖像,Image-Pro Plus軟件分析目的條帶灰度值,以目的蛋白與內參蛋白GAPDH的灰度比值來表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性比較各組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性之間差異有統計學意義(F=264.127,P<0.001)。與對照組比較,模型組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性降低(P<0.05),且高劑量RVD1組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性低于低劑量RVD1組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織β-半乳糖苷酶活性檢測結果

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態學變化情況比較HE染色結果顯示,對照組大鼠心肌組織結構清晰,心肌細胞整齊排列,染色均勻;模型組大鼠心肌組織發生明顯損傷,心肌纖維排列紊亂且有斷裂,心肌細胞出現壞死、水腫現象;與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌纖維與心肌細胞形態明顯得到改善,此外,高劑量RVD1組大鼠心肌組織趨于對照組,未見明顯損傷。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理形態學變化 HE ×100

2.3 各組大鼠心肌組織膠原纖維沉積情況比較Masson染色結果顯示,各組大鼠心肌組織CVF之間差異有統計學意義(F=314.259,P<0.001)。對照組大鼠心肌組織內未見明顯藍染的膠原纖維沉積,而模型組大鼠心肌組織內有大量藍染的膠原纖維沉積,CVF升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織內藍染的膠原纖維沉積均明顯減少,CVF降低(P<0.05),且高劑量RVD1組要CVF低于低劑量RVD1組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織膠原沉積染色結果 Masson×100

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡比較TUNEL染色結果顯示,各組大鼠心肌組織TUNEL陽性細胞比例之間差異有統計學意義(F=478.841,P<0.001)。模型組大鼠心肌組織內TUNEL陽性細胞比例(64.28±6.04)%多于對照組(2.16±0.22)%(P<0.05),心肌細胞凋亡明顯;與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織內TUNEL陽性細胞比例(19.87±1.79)%、(12.30±1.16)%均減少(P<0.05),心肌細胞凋亡受到抑制;與低劑量RVD1組比較,高劑量RVD1組大鼠心肌組織內TUNEL陽性細胞比例進一步減少(P<0.05),心肌細胞凋亡更少。見圖4。

2.5 各組大鼠心肌組織內自噬水平比較免疫組化S-P法結果顯示,各組大鼠心肌組織內自噬標志物LC3蛋白陽性率之間差異有統計學意義(F=288.645,P<0.001)。與對照組比較,模型組大鼠心肌組織內LC3蛋白陽性率下降(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織內LC3蛋白陽性率增加(P<0.05),且高劑量RVD1組大鼠心肌組織內LC3蛋白陽性率高于低劑量RVD1組(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織自噬標志物LC3表達檢測結果 S-P×100

Western blot檢測結果顯示,各組大鼠心肌組織內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1和p62蛋白相對表達量之間差異有統計學意義(F=56.241、89.472、132.418,均P<0.001)。與對照組比較,模型組大鼠心肌組織內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,Beclin-1蛋白相對表達量下調而p62蛋白相對表達量上調(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,Beclin-1蛋白相對表達量上調而p62蛋白相對表達量下調(P<0.05);與低劑量RVD1組比較,高劑量RVD1組大鼠心肌組織內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值進一步升高,且Beclin-1蛋白相對表達量上調、p62蛋白相對表達量下調(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠心肌組織內自噬相關蛋白表達檢測結果

2.6 各組大鼠心肌組織內MAMs變化情況比較透射電鏡觀察結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠心肌組織MAMs結構疏松,占線粒體周長百分比減少(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組MAMs結構較為緊密,占線粒體周長百分比增加(P<0.05);與低劑量RVD1組比較,高劑量RVD1組MAMs結構更加緊密,占線粒體周長百分比也增加(P<0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠心肌組織內MAMs結構變化觀察結果

Western blot檢測結果顯示,各組大鼠心肌組織內GRP75、VDAC1、Mfn2蛋白相對表達量之間差異有統計學意義(F=112.457、64.193、45.208,均P<0.001)。與對照組比較,模型組大鼠心肌組織中GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對表達量下調(P<0.05);與模型組比較,低劑量RVD1組與高劑量RVD1組大鼠心肌組織中GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對表達量上調(P<0.05);高劑量RVD1組大鼠心肌組織中GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對表達量均要高于低劑量RVD1組(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組大鼠心肌組織內MAMs相關蛋白表達檢測結果

3 討論

關于RVD1在心血管疾病中的保護作用已有報道,例如,Wang et al[7]研究表明RVD1改善了阿霉素誘導的小鼠心臟毒性,減少心肌細胞凋亡,其機制可能與抑制炎癥、氧化應激和內質網應激有關;Salas-Hernández et al[8]指出RVD1能夠抑制血管緊張素II誘導的心臟成纖維細胞分泌細胞炎癥因子與細胞黏附蛋白,減輕心臟組織重塑,并有助于受損心臟組織的修復。該研究通過使用RVD1處理衰老大鼠后,檢測結果顯示,心肌組織內β-半乳糖苷酶活性降低,心肌纖維與心肌細胞受損得到改善,藍染的膠原纖維沉積減少,由此說明,RVD1能夠有效改善衰老大鼠心肌受損現象。

自噬是一種廣泛存在于真核細胞中的代謝途徑,通過溶酶體機制降解受損的細胞器和蛋白質。已知自噬在衰老的心肌組織中受到抑制,會導致心肌細胞穩態降低,促使心肌細胞凋亡,相反,增強自噬有助于減緩衰老相關心肌細胞凋亡、心臟肥大及纖維化,延緩心臟衰老[9]。一旦自噬被激活,可溶性LC3-Ⅰ蛋白通過磷脂酰乙醇胺的共價偶聯形成LC3-Ⅱ,這對于自噬體的生成和伸長至關重要,因此,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低則表明自噬受限[10]。該研究通過對衰老大鼠心肌組織進行檢測顯示,LC3蛋白陽性率下降,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,Beclin-1蛋白相對表達量下調,p62蛋白相對表達量上調,TUNEL標記的心肌細胞凋亡增加,以上結果說明衰老大鼠心肌組織內自噬功能障礙,增加了心肌細胞凋亡。而RVD1處理的衰老大鼠心肌組織中LC3蛋白陽性率增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,Beclin-1蛋白相對表達量上調而p62蛋白相對表達量下調,TUNEL標記的心肌細胞凋亡明顯減少,該結果顯示RVD1能夠提高衰老大鼠心肌組織內自噬水平,抑制心肌細胞凋亡。

MAMs介導多種細胞功能,包括鈣穩態調節、脂質代謝、未折疊蛋白反應、線粒體動力學、自噬等,這些都是心血管疾病的關鍵危險因素。此外,MAMs與衰老或衰老過程密切相關,已知衰老性肌萎縮的發生與MAMs處鈣離子轉移異常、內質網應激等有關,通過運動調節MAMs能夠緩解衰老性肌萎縮[11]。有研究[12]表明,HIV-1病毒TAT蛋白誘導神經元細胞會破壞MAMs結構,引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累及線粒體應激,并改變MAMs相關蛋白表達,從而導致大腦過早衰老。MAMs的形成依賴于內質網和線粒體上的互補膜蛋白將兩個細胞器在特定位置連接在一起。因此,MAMs上某些蛋白質的缺失或某些蛋白之間相互作用的中斷會導致MAMs結構和功能的破壞。VDAC1通過GRP75與內質網上的肌醇1,4,5-三磷酸1型受體相互作用,介導鈣離子從內質網轉移到線粒體上,這對于維持MAMs結構與功能至關重要[13]。Mfn2在MAMs有定位,通過形成同源或異源二聚體將2個相鄰的線粒體與Mfn1連接起來來介導外線粒體膜融合,其功能喪失會降低線粒體融合效率并誘導線粒體碎裂,破壞MAMs[14]。該研究經檢測顯示,衰老大鼠心肌組織MAMs結構疏松,占線粒體周長百分比減少,GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對表達量也下調,說明心肌組織內MAMs結構與功能受損。此外,經過RVD1處理的衰老大鼠心肌組織MAMs結構較為緊密,占線粒體周長百分比增加,同時,GRP75、VDAC1及Mfn2蛋白相對表達量也上調,由此推測,RVD1能夠調節衰老大鼠心肌組織內MAMs,從而對心肌組織起到保護作用。