LINC00092對神經膠質瘤增殖、遷移和侵襲的影響

楊金亮,李 佳,安 靜,郗玉巧,葉 雷,程宏偉

神經膠質瘤是一種極易惡化的,起源于神經組織中膠質細胞的腫瘤[1]。患者初期一般表現為頭痛、嘔吐和視力視野改變,隨著疾病的進一步加深,會出現持續性頭痛、癲癇發作、記憶力下降和腦疝等顯著癥狀[2]。亞硝基化合物、遺傳、電離輻射、腦部疾病史等已被廣泛認為是影響神經膠質瘤發生和發展的主要因素[3],但具體的病因尚不完全明確。由于神經膠質瘤細胞具有免疫逃逸能力,機體很難對其產生特異性殺傷,從而有效避免了免疫系統的抑制和清除。由于個體差異,不同患者的腫瘤病類型往往也存在著很大的區別。因此,迫切需要了解神經膠質瘤進展的關鍵分子機制,以制定更有效的治療方法。該研究中,首先利用數據庫對LINC00092在泛癌中的表達以及臨床意義進行了相關分析。接著通過體外實驗分析了LINC00092對神經膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響,以及LINC00092對胰島素樣生長因子2結合蛋白1(insulin-like growth factor 2 binding protein 1,IGF2BP1)的調控作用。研究旨在闡明LINC00092在神經膠質瘤發生和發展過程中的調控機制,可能為診斷和治療神經膠質瘤提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 公共數據庫分析LINC00092在泛癌中的表達和預后基因型-組織表達數據庫(genotype-tissue expression,GTEx;http://commonfund.nih.gov/GTEx/)包含了大量健康人體組織的RNA測序數據,常在癌癥的研究中與癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數據庫聯合使用。基于TCGA和GTEx數據庫中的樣本信息,檢測了LINC00092在泛癌中表達。借助R軟件,對LINC00092在泛癌中的總體生存(overall survival,OS)預后進行了單變量Cox回歸分析,繪制了森林圖,并并計算了相應的P值和95%置信區間下的風險比(HR)。

1.2 細胞培養從中國科學院上海細胞庫購買該實驗所用到的膠質瘤細胞(U87),將其放置在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的杜爾貝科改良伊格爾培養基(dulbecco′s modified eagle mediun,DMEM)中,并往該培養基中添加1%的青-鏈霉素。在含有5%CO2的恒溫細胞培養箱中培養細胞,培養條件37 ℃。

1.3 質粒和轉染對于細胞的轉染,首先將U87細胞以每孔1×105的密度添加到6孔板中。LINC00092的過表達質粒購自上海Genechem公司,以空載體pcDNA3.1作為陰性對照。其次,按照說明書,通過Lipofactamine 2000對細胞進行質粒的轉染。

1.4 熒光定量PCR技術使用TRIzol試劑提取U87細胞中的總RNA,通過測量260和280 nm處的相對吸光度來評估RNA質量,通過逆轉錄試劑盒將逆轉錄為互補DNA。在通過SYBR Green的方法對互補DNA進行熒光定量PCR檢測。在Applied Biosystems 7500實時熒光定量PCR系統中進行檢測。隨后借助2-ΔΔCt的方法計算相對表達水平。

1.5 細胞增殖實驗對于細胞的增殖實驗,使用CCK-8試劑盒進行檢測。首先將轉染后的U87細胞以2×103的密度接種在96孔板中,檢測前每個孔中加入10 μl的CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h。通過酶標儀分別在0、24、48、72和96 h檢測細胞在450 nm處的吸光度,并描繪生存力曲線以此來觀察細胞增殖的活力。

1.6 細胞遷移和侵襲實驗利用Transwell對U87細胞進行遷移和侵襲的檢測。首先,將轉染后的U87細胞用無血清DMEM培養基稀釋,添加到Transwell小室的上層腔室,對于侵襲實驗,在Transwell中加入基質膠,而遷移實驗則不需要。之后在Transwell的下層腔室中添加含有10%FBS的DMEM培養基。經過一段時間的孵育后,取出小室,用棉簽擦除上層腔室多余的細胞。隨后用多聚甲醛固定遷移和侵襲的細胞,并用0.1%的結晶紫進行染色。最后通過光學顯微鏡觀察細胞遷移和侵襲的數量,進行比較分析。

1.7 細胞凋亡檢測對于細胞凋亡檢測,將轉染后的U87細胞48 h內用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗2次,并用100 μl結合緩沖液重懸在避光環境中,對其進行膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙錠的雙重染色。隨后按照制造商提供的指示,通過流式細胞儀進行細胞凋亡分析。

1.8 蛋白質印跡實驗利用RIPA裂解液從U87細胞中提取總蛋白,通過BCA蛋白質定量試劑盒測量提取的蛋白質濃度。隨后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質并轉移到PVDF膜上。將膜在5%脫脂乳中封閉3 h,與anti-IGF2BP1(1 ∶1 000)和anti-GAPDH(1 ∶10 000)在4 ℃的環境下孵育過夜。經磷酸鹽緩沖液沖洗后,利用ECL化學發光試劑盒檢測IGF2BP1的蛋白質的表達水平。

2 結果

2.1 LINC00092在泛癌中表達情況通過TCGA和GTEx數據庫中的樣本,分析了LINC00092在泛癌中的表達情況,如圖1A-D所示,LINC00092在絕大多數癌癥的腫瘤組織中低表達,如腎上腺皮質癌(adrenal cortical carcinoma,ACC),膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA),乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma,BRCA)和多形成性膠質細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)等。此外,森林圖也展示了LINC00092在泛癌中的OS的單變量Cox回歸分析,根據P<0.05的前提,觀察到LINC00092在ACC(P=0.008 6)、BRAC(P=0.009 7)、GBM(P=0.013 3),腦低級腦膠質瘤(LGG)(P<0.000 1)、肝細胞肝癌(LIHC)(P=0.039 2)、肺腺癌(LUAD)(P=0.040 5)中具有顯著的預后價值(圖2)。

圖1 公共數據庫檢測LINC00092在泛癌中表達情況

圖2 LINC00092對TCGA泛癌中OS的單因素Cox回歸結果

2.2 LINC00092抑制U87細胞的發展并調控IGF2BP1的表達在LINC00092的神經膠質瘤細胞實驗中,首先基于熒光定量PCR技術檢測到經pcDNA3.1轉染后的LINC00092在U87細胞中的表達上調(圖3A)。CCK-8試劑盒也檢測到,與對照組(pcDNA)相比,過表達LINC00092組(pcDNA3.1-LINC00092)U87細胞的增殖活力降低(P<0.01)(圖3B)。Transwell的結果也顯示與對照組(pcDNA)相比,過表達LINC00092組(pcDNA3.1-LINC00092)U87細胞的遷移和侵襲數量降低(P<0.000 1)(圖4A、B)。反之,流式細胞術檢測到與對照組(pcDNA)相比,過表達LINC00092組(pcDNA3.1-LINC00092)的U87細胞的凋亡增加(P<0.05),如圖5所示。因此,推斷LINC00092作為神經膠質瘤的抑癌因子,上調其在膠質瘤細胞中的表達后腫瘤細胞的活力降低。此外,熒光定量PCR技術檢測到與對照組(pcDNA)相比,過表達LINC00092組(pcDNA3.1-LINC00092)的IGF2BP1的表達降低(P<0.01),而蛋白質印跡實驗則顯示過表達LINC00092后IGF2BP1蛋白的表達也下降(P<0.05)(圖6A、B)。這表明了LINC00092能夠通過靶向IGF2BP1的表達,影響神經膠質瘤細胞的生長過程。

圖3 LINC00092對U87細胞增殖的影響

圖4 LINC00092對U87細胞遷移和侵襲的調控 ×200

圖5 LINC00092對U87細胞凋亡的影響

圖6 LINC00092下調IGF2BP1在U87細胞中的表達

3 討論

神經膠質瘤屬于中樞神經系統腫瘤,其5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌,往往導致高致殘率。當前關于神經膠質瘤患者的治療主要是以手術切除為主,但因腫瘤難以完全切除,一般還以綜合治療即放療、化療等為輔,從而延長患者的5年生存以及遏制腫瘤的復發率[4-5]。隨著生物科學技術的發展,基因、免疫等新型療法也逐步應用于神經膠質瘤的研究中[6]。考慮到患者的個體差異性較大,腫瘤發病部位的不同,并且神經膠質瘤具有高異質性和治療抵抗的特點,臨床治療效果也會有所不同,部分患者的預后往往較差。因此,基于生物信息學的方法對公共數據庫中的神經膠質瘤數據進行探究,能夠為尋找有效治療靶點提供新思路。

在當前的臨床生物學領域,通過生物信息學的方法對TCGA數據庫中的癌癥進行了遺傳學、表觀遺傳學等研究,以此掌握癌癥發病機制[7-8]。相關研究表明lncRNA可在癌癥診斷與預后中作為有效生物標志物,為癌癥的預防、治療提供了有價值的線索。該研究基于公共數據庫評估得到LINC00092在多個癌癥的腫瘤樣本中顯著低表達,并且對ACC、BRCA、LUAD等腫瘤具有顯著的預后價值。尤其重要的是分析結果顯示LINC00092在LGG和GBM中低表達,而單因素Cox分析顯示LINC00092在LGG和GBM中是危險預后因素(HR>1)。通過數據庫分析的結果顯示LINC00092可能是神經膠質瘤預后中的重要標志物。

作為一種長鏈非編碼RNA,LINC00092參與一些疾病發展過程中的調控,并與一些腫瘤的發生和發展相關。Chen et al[9]研究表明LINC00092主要在心臟成纖維細胞中表達,可通過抑制糖酵解來減弱人心臟成纖維細胞激活。Li et al[10]在甲基化驅動基因與乳腺癌的研究中通過分析顯示LINC00092在乳腺癌中低表達,是導致乳腺癌的不良預后的因素,上調其表達能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和細胞周期。其他研究還指出LINC00092在肺腺癌中低表達,下調LINC00092表達會對肺腺癌的遷移和侵襲產生影響,并且LINC00092可能與肺腺癌的不良預后有關[11]。然而,關于LINC00092在神經膠質瘤細胞中的作用機制還不明確,該研究旨在進一步闡明LINC00092在神經膠質瘤中的作用機制,LINC00092可能是神經膠質瘤中的重要標志物。

在體外細胞實驗中,通過CCK-8、Transwell和流式細胞術的方法顯示上調LINC00092在神經膠質瘤細胞中的表達會導致U87細胞增殖、遷移受到顯著抑制,并加速U87細胞的凋亡進程,這表明LINC00092在神經膠質瘤的中發揮著抑癌作用。此外,結合網站ENCORI: The Encyclopedia of RNA Interactomes. (sysu.edu.cn) 預測得到LINC00092可能調控IGF2BP1的表達。通過qRT-PCR和Western blot的方法檢測到LINC00092負向調控IGF2BP1在神經膠質瘤細胞中的表達水平。IGF2BP1是一種蛋白質編碼基因,與甲狀腺肉瘤和結直腸癌、卵巢癌等疾病相關[12]。研究[13]表明IGF2BP1的過表達促進膠質瘤細胞進展,microRNA-4500通過靶向該基因能抑制神經膠質瘤細胞的發展。Wang et al[14]的研究表明miR-873通過下調IGF2BP1的表達能達到同樣抑制膠質母細胞瘤的發生和轉移的效果。因此,LINC00092可能通過靶向IGF2BP1的表達影響神經膠質瘤的發生和發展,該研究存在一定的局限性,在后續的研究中,將進一步通過實驗闡明LINC00092靶向IGF2BP1作用機制。