激活突變引發SHP2蛋白相分離對小鼠間充質干細胞增殖能力的影響及其機制

劉 嘉,戴媛娟,汪思應

SHP2是由PTPN11基因編碼的非受體型酪氨酸磷酸酶,PTPN11的激活突變與多種腫瘤的發生密切相關,除了非小細胞性肺癌[1]、乳腺癌[2]、血液系統腫瘤[3]等常見腫瘤外,在人類的橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)中也發現了PTPN11的激活突變[4]。肉瘤是一種復雜的間葉腫瘤,其發生的潛在分子機制仍未完全明了,其中大部分原因是對其細胞起源缺乏共識,但現在越來越多的證據表明它們來源間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)[5]。與此同時,相分離作為一種與腫瘤發生相關的機制被越來越多地提及,它是指生物體內的大分子物質之間由于多價相互作用而聚集在一起,形成生物分子冷凝物的現象[6]。有研究[7]提示激活突變的SHP2蛋白會在細胞內形成大量的生物分子冷凝物,然而激活突變SHP2蛋白的相分離與人類橫紋肌肉瘤的發生之間的聯系還有待探究。該研究構建SHP2E76K突變的小鼠模型,探究激活突變引發的SHP2蛋白相分離對小鼠MSC增殖能力的影響及其機制,以期為肉瘤的診斷和治療尋找新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 本研究所用Ptpn11E76K-neo/+小鼠(C57BL/6J品系),由美國埃默里大學血液/腫瘤系的瞿成奎教授贈予, Mx1-cre(C57BL/6J品系)小鼠購自上海南方模式生物研究中心,于安徽醫科大學基礎醫學院動物實驗中心SPF級環境中飼養。本研究對照組小鼠為Mx1-cre; Ptpn11+/+(C57BL/6J品系),實驗組小鼠為Mx1-cre; Ptpn11E76K/+(C57BL/6J品系)。該研究的動物實驗均經安徽醫科大學動物倫理委員會批準(批準號:LLSC20210807)。

1.1.2主要試劑 瓊脂糖粉末購自北京蘭杰柯科技有限公司;鼠尾鑒定聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購自成都福際生物技術有限公司;胎牛血清購自美國普諾賽公司;高糖DMEM細胞培養基、低糖DMEM細胞培養基均購自美國Gibico公司;細胞培養皿、細胞計數板均購自美國康寧公司;SHP2抗體、p-ERK抗體、ERK抗體、p-AMPK抗體、AMPK抗體、p-mTOR 抗體、m-TOR抗體均購自美國CST公司;β-actin抗體購自美國Proteintech公司;SHP099購自美國Selleck公司;ET070由中國科學院上海有機化學研究所提供;預染蛋白分子量Marker購自美國賽默飛公司;細胞總蛋白裂解液、CCK-8試劑盒、二甲亞砜、PBS粉末均購自美國Sigma公司。

1.1.3主要儀器 CO2細胞培養箱(德國Eppendorf公司,型號:Galaxy170S);正置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,型號:TMT2-21);倒置顯微鏡(日本尼康公司,型號:ECLIPSE TS100);細胞計數儀(江蘇卓微生物科技有限公司,型號:JIMBIO CL);普通PCR儀(德國Biometra公司,型號:2506261);多功能酶標儀(型號:Varioskan)、低溫冷凍離心機(型號:Heraeus Megafuge 16)(美國賽默飛公司);生物安全柜(美國Labconco公司,型號:Type A2); 化學發光凝膠成像儀(美國 BIO-RAD公司,型號:ChemiDoc MP);電泳儀(德國 Eppendorf公司,型號:Powerpac Basic Power Supply)

1.2 方法

1.2.1小鼠尾部組織基因組DNA的提取 子鼠1周齡時,將小鼠尾部組織剪取長約0.2 cm的小段于1.5 ml EP管中,在EP管中加入50 μl Buffer MP,2 μl Foregene Protease Plus,65 ℃金屬浴30 min,然后95 ℃水浴5 min,8 000 r/min離心5 min。

1.2.2PCR擴增反應及瓊脂糖凝膠電泳進行的基因型鑒定 小鼠基因型鑒定引物序列: E76KNeo Forward,5′-TGGGAAGACAATAGCAGGCA-3′;E76KNeo Reverse,5′-CCCACTCACCTTGTCATGTA-3′; Mx1-cre Forward,5′-GACCAGGTTCGTTCACTC-3; Mx1-cre Reverse,5′- TAGCGCCGTAAATCAAT-3′。PCR反應體系:2×PCR反應緩沖液10 μl,前引物0.5 μl,后引物0.5 μl,超純水5 μl,DNA模板4 μl,總體積20 μl。PCR反應程序:E76K擴增反應程序為:① 94 ℃、3 min;② 94 ℃、30 s;③ 55 ℃、30 s;④ 72 ℃、30 s;⑤ 72 ℃、5 min;⑥ 4 ℃保持。②～④為循環反應,循環數為32。Mx1-cre擴增反應程序為:① 94 ℃、3 min;② 94 ℃、30 s;③ 58 ℃、30 s;④ 72 ℃、60 s;⑤ 72 ℃、5 min;⑥ 4 ℃保持。②～④為循環反應,循環數為28。瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖1.5 g,5×TAE緩沖液2 ml,雙蒸水98 ml,溴化乙啶(EB)5 μl,DNA 樣本10 μl,電泳電壓90 V,時間40 min,凝膠成像儀成像。

1.2.3Mx1-cre;Ptpn11E76K/+小鼠的獲得 取經PCR鑒定的基因型Mx1-cre;Ptpn11E76K/+的小鼠,待其長至4周齡時按照20 μg/只的劑量腹腔注射pI-pC,每隔1 d注射1次,共3次,注射完成后30 d左右即可用于實驗。

1.2.4原代骨髓MSC的分離 取基因型為Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+的雄性小鼠,脫頸處死后放入75%的乙醇中消毒10 min,在生物安全柜內,按照無菌操作原則分離其股骨和脛骨,用PBS清洗,剪去兩側干骺端,用1 ml注射器吸取PBS反復沖洗骨髓腔直至骨髓腔發白為止,收集骨髓沖洗液置于15 ml離心管中;1 000 r/min離心5 min后去上清液,用含10%FBS的低糖DMEM完全培養基吹打沉淀,制成單細胞懸液,以1×105個/ml為密度將細胞接種在大皿中,放入細胞培養箱中培養;2 d后半換液,5 d后全換液,之后每2～3 d換1次液,當細胞長至80%進行傳代,傳至第3代用于實驗。

1.2.5MSC的鑒定 在24孔板中放入細胞爬片,取正在培養的第3代Ptpn11E76K/+和Ptpn11+/+MSC消化后制成單細胞懸液并計數,保持每孔液體體系為0.5 ml,每孔種入2×104個細胞,每組3個復孔,共兩組,在37 ℃、5%CO2濃度條件下培養48 h,之后吸棄各孔培養基,加入4%的多聚甲醛固定0.5 h,室溫下用10%的山羊血清封閉1 h,用含有1%BSA和0.25% Triton X-100的PBS以200 ∶1的比例稀釋一抗(Sca-1),每孔加入200 μl,4 ℃孵育過夜(超過12 h),用上述試劑以1 000 ∶1稀釋二抗,每孔加入200 μl,避光條件下在常溫孵育1.5 h,用DAPI室溫避光染細胞核5 min,滴加抗熒光淬滅劑封片,風干并拍照計數。

1.2.6細胞免疫熒光實驗 在24孔板中放入細胞爬片,取正在培養的第3代Ptpn11E76K/+和Ptpn11+/+MSC消化后制成單細胞懸液并計數,每孔種入2×104個細胞,每組3個復孔,共6組;4～6 h后,對照組和實驗組分別換上完全培養基和加了相應濃度的分子變構抑制劑(SHP099和ET070的濃度均為20 μmol/L)的培養基,在細胞培養箱中培養48 h,期間每24 h更換相應的培養基;48 h后,吸棄各孔培養基,后續操作參照1.2.5項進行。

1.2.7Western blot實驗 消化離心的細胞沉淀用RIPA重懸,置于冰上30 min,每4～5 min振蕩3～5 s,在4 ℃條件下以12 000 r/min離心20 min,吸出上清液轉移至新1.5 ml EP管;用BCA方法測蛋白濃度并繪制標準曲線;按照5×上樣緩沖液體積:蛋白體積為1 ∶4,加入上樣緩沖液,99 ℃水浴加熱蛋白10 min;制備SDS-PAGE凝膠,根據BCA結果上樣后進行電泳和PVDF膜轉膜,用5%的脫脂牛奶封閉1 h以上,分別將膜置于稀釋好的一抗中,4 ℃條件下孵育過夜,TBST洗膜,室溫孵育二抗1 h,洗膜后顯影。

1.2.8CCK-8實驗 取狀態良好的細胞進行離心消化并計數,將細胞懸液調制濃度為1×104/ml,96孔板每孔加入200 μl細胞懸液,每組5個復孔,每板6組,需要4個96孔板(0、24、48、72 h);鋪板后4～6 h后實驗組和對照組分別換成加變構抑制劑的完全培養基和普通完全培養基,培養至相應時間點后取出檢測(0 h的無需繼續培養),期間每24 h更換每個孔相應的培養基;當達到相應時間時,取出孔板,在各孔中加入20 μl CCK-8溶液,培養箱中繼續孵育2～4 h;孵育結束后,用酶標儀檢測其在480 nm處吸光度值。

2 結果

2.1 小鼠基因型鑒定結果將工具鼠Mx1-cre與Ptpn11E76K-neo/+的C57BL/6小鼠雜交,得到的小鼠通過基因型鑒定確定得到Mx1-cre;Ptpn11+/+(2、10、15、18、19、21、24、25、26號)和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+(3、4、7、9、10號)小鼠。見圖1。

圖1 小鼠基因型鑒定結果

2.2 MSC細胞形態及鑒定分離Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+兩種基因型小鼠的MSC并進行體外傳代培養,在培養過程中觀察到MSC呈集落式貼壁生長,細胞呈梭形,放射狀排列,并伸出長短不一粗細不均的突起并且伴隨傳代數增加,細胞形態趨于統一。見圖2A。細胞免疫熒光檢測顯示,第3代細胞的表面抗原蛋白均表達干細胞表面抗原Sca-1(圖2B、C),由此可確定分離所得細胞為MSC。

圖2 成功分離并培養Ptpn11+/+和Ptpn11E76K/+ MSC

2.3 細胞免疫熒光實驗觀察變構抑制劑SHP099和ET070對Ptpn11E76K/+激活突變的MSC內的SHP2的相分離現象的影響細胞免疫熒光染色結果顯示,與Ptpn11+/+組相比,Ptpn11E76K/+組MSC在顯微鏡下可觀察到更多的SHP2蛋白由相分離而產生的生物分子冷凝物,且兩組MSC細胞內形成的冷凝物的數量差異有統計學意義(圖3A,t=21.62,P<0.000 1);與Ptpn11E76K/+組相比較,Ptpn11E76K/++SHP099組和Ptpn11E76K/++ET070組的MSC在顯微鏡下可見的SHP2蛋白由相分離而產生的生物分子冷凝物明顯減少,差異有統計學意義(圖3B,tSHP099=20.54,tET070=23.88,P<0.000 1)。Western blot實驗表明,野生型和突變型MSC以及添加變構抑制劑SHP099和ET070作用之后,細胞內SHP2蛋白本身的表達水平幾乎沒有差異(圖3C)。

圖3 免疫熒光檢測實驗組和對照組SHP2蛋白由于相分離產生的冷凝物液滴數量并且通過Western blot實驗檢測實驗組和對照組SHP2蛋白的表達差異

2.4 MSC中E76K突變的SHP2蛋白的相分離被抑制后干細胞的增殖能力的變化用CCK-8試劑盒檢測6個組細胞藥物作用后第0、24、48、72 h 4個時間段細胞生長密度及各組各個時間點吸光度值并進行統計分析,如圖4所示,實驗結果顯示,與SHP2E76K突變組相比,SHP2WT組(t=10.36,P<0.01)、SHP2E76K+SHP099組(t=42.31,P<0.001)、SHP2E76K+ET070組(t=32.02,P<0.000 1)細胞的吸光度值均下降,差異有統計學意義。結果提示MSC增殖能力較差。

圖4 MSC的SHP2發生E76K突變以及相分離被抑制之后細胞增殖能力的變化

2.5 抑制Ptpn11E76K/+突變的MSC中SHP2的相分離之后MSC ERK及AMPK-mTOR信號通路部分相關蛋白活化的改變提取藥物處理了48 h的野生型和突變型的MSC的總蛋白,通過Western blot實驗檢測與細胞增殖和代謝相關的蛋白的表達水平,結果顯示:與Ptpn11+/+組相比,Ptpn11+/++SHP099組(t=22.2,P<0.000 1)、Ptpn11+/++ET070組(t=55.8,P<0.000 1)p-ERK蛋白表達減少;與Ptpn11E76K/+組相比,Ptpn11E76K/++SHP099組(t=96.87,P<0.000 1)、Ptpn11E76K/++ET070組(t=41.14,P<0.000 1)p-ERK蛋白表達減少(圖5B、C)。此結果提示SHP2相分離被抑制后Ptpn11E76K/+MSC ERK蛋白活化程度降低(圖5A)。AMPK-mTOR信號通路相關蛋白表達檢測顯示:mTOR蛋白、AMPK蛋白的相對表達量在實驗組和對照組之間差異無統計學意義(圖5E、F)。而p-AMPK蛋白的相對表達統計結果顯示:與Ptpn11+/+組相比較,Ptpn11+/++SHP099組(t=4.573,P<0.05)、Ptpn11+/++ET070組(t=10.25,P<0.001)蛋白表達增加;與Ptpn11E76K/+組相比較, Ptpn11E76K/++SHP099組(t=174.3,P<0.000 1)、Ptpn11E76K/++ET070組(t=74.82,P<0.000 1)蛋白表達增加(圖5G)。p-mTOR蛋白的相對表達統計結果顯示:與Ptpn11+/+組相比,Ptpn11+/++SHP099組(t=46.98,P<0.000 1)、Ptpn11+/++ET070組(t=38.27,P<0.000 1)蛋白表達減少;與Ptpn11E76K/+組相比, Ptpn11E76K/++SHP099組(t=37.39,P<0.000 1)、Ptpn11E76K/++ET070組(t=113.3,P<0.000 1)蛋白表達減少(圖5H);p70s6k蛋白的相對表達統計結果顯示:與Ptpn11+/+組相比,Ptpn11+/++SHP099組(t=47.00,P<0.000 1)、Ptpn11+/++ET070組(t=19.38,P<0.000 1)蛋白表達減少;與Ptpn11E76K/+組相比,Ptpn11E76K/++SHP099組(t=43.29,P<0.000 1)、Ptpn11E76K/++ET070組(t=49.63,P<0.000 1)蛋白表達減少(圖5I)。此結果提示,SHP2相分離被抑制后,Ptpn11E76K/+MSC AMPK蛋白被活化,并且mTOR的磷酸化被抑制,導致下游蛋白p70s6k表達減少(圖5D)。

圖5 Western blot檢測各組MSC細胞總蛋白中ERK通路、AMPK-mTOR通路部分蛋白的表達情況及統計圖

3 討論

據相關報道[4],在橫紋肌肉瘤中發現了Ptpn11的激活突變,但其機制尚不清楚。Ptpn11是一種原癌基因,它編碼的SHP2蛋白是非受體蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一員。SHP2蛋白的構象在生理狀態下自我抑制,幾乎沒有催化活性,當Ptpn11發生突變導致SHP2蛋白活性異常時,蛋白的蛋白酪氨酸磷酸酶結構域暴露,從而使酪氨酸磷酸酶活性的作用發揮出來[8]。研究[7,9-10]表明在SHP2異常突變中,E76K突變為第76位的谷氨酸突變為賴氨酸,其SHP2的磷酸酶催化活性相較于其他突變較高,是目前Ptpn11突變中最活躍的激活突變之一。而肉瘤的發生與MSC的惡性轉化之間有密切聯系,MSC的轉化主要通過敲除抑癌基因、過表達癌基因和給藥影響信號通路等方法實現[5,11]。近年來,大量研究表明癌癥的發生與原致癌蛋白相分離有關[12-14],但是肉瘤的發生發展與蛋白相分離是否有關,目前還沒有相關研究報道。

課題組既往的實驗[3]表明,SHP2E76K突變細胞增殖能力遠遠高于野生型細胞,而細胞的惡性轉化總是伴隨惡性增殖。本研究利用了Ptpn11E76K/+激活突變類型小鼠,分離與肉瘤發生密切相關的MSC作為實驗工具,通過使用兩種分子構象抑制劑(SHP099和ET070)抑制SHP2E76K激活突變蛋白的相分離,檢測相分離被抑制之后突變細胞增殖能力的變化及相應蛋白表達的改變。實驗結果顯示SHP2E76K激活突變后蛋白在細胞內產生了更多相分離,并且由此刺激了ERK及AMPK-mTOR信號通路活化,促進了MSC增殖。由于細胞的惡性轉化總是伴隨著細胞增殖能力異常增強,可以以此為切入點,深入探究SHP2激活突變的蛋白產生的相分離與MSC惡性轉化之間關系,并可以進一步研究肉瘤治療新的靶點,為其臨床治療提供新的依據。