長鏈非編碼RNA-GAS5競爭性結(jié)合miR-10調(diào)控SiHa細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響*

王陽陽,劉 耘,楊紅梅,董仙萍,劉桂艷△

1.河北省唐山中心醫(yī)院婦科,河北唐山 067000;2.河北省開灤總醫(yī)院婦科,河北唐山 067000;3.河北省唐山市婦幼保健院婦科,河北唐山 067000

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一[1-2],相關(guān)研究已證實(shí)人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌的主要病因[3-4],其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響及限制宮頸癌患者生存率的主要問題[5],所以深入了解宮頸癌的發(fā)病機(jī)制,將有助于確定該疾病新的治療及預(yù)后靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類不具備編碼蛋白功能的RNA,研究證實(shí)lncRNA水平異常與多種疾病發(fā)展有關(guān)[6-7],有研究顯示, 在宮頸癌患者中,lncRNA小核RNA宿主基因1(SNHG1)在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞系中均呈高水平; LIANG等[8]發(fā)現(xiàn)lncRNA分化拮抗非蛋白質(zhì)編碼RNA(DANCR)通過與微小RNA-335-5p(miR-335-5p)競爭結(jié)合調(diào)控Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶1(ROCK1)從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展。lncRNA-生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄5(GAS5)是5′TOP RNA。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-GAS5在前列腺癌和乳腺癌中是一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因[9-10],但lncRNA-GAS5對(duì)宮頸癌的影響鮮有報(bào)道。因此本研究旨在分析lncRNA-GAS5、微小RNA-10(miR-10)及靶基因的相互關(guān)系,觀察三者對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,初步探究lncRNA-GAS5在宮頸癌病理過程中的作用。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年1月在河北省唐山中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的48例宮頸癌手術(shù)患者作為研究對(duì)象,平均年齡為(51.16±14.26)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化學(xué)治療;接受宮頸癌手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn):臨床資料不全者。所有患者或家屬均簽署知情同意書,本研究通過河北省唐山中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 收集所有研究對(duì)象的腫瘤樣本和癌旁正常組織樣本置于-80 ℃環(huán)境中保存,提取人宮頸癌細(xì)胞株。將人子宮頸鱗癌(SiHa)細(xì)胞保存在含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,在37 ℃含5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h將SiHa細(xì)胞接種到6孔板,按照轉(zhuǎn)染試劑說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別將si-NC、lncRNA-GAS5、miR-10、血小板反應(yīng)蛋白(THBS)2、lncRNA-GAS5+miR-10、lncRNA-GAS5+miR-10+THBS2轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞,按照轉(zhuǎn)染方式的不同將培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞分為對(duì)照組、GAS5組、miR-10組、THBS2組、GAS5+miR-10組和GAS5+miR-10+THBS2組。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 用TRIzol試劑提取細(xì)胞、組織中的總RNA, miR-10水平以U6或三磷酸甘油醛(GAPDH)作為內(nèi)部參照,按照qRT-PCR試劑盒說明書,進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列如下:GAS5正引向引物為5′-GGAAGCTGGATAACAGAGCGA-3′,反向引物為5′-GGTATTCCTTGTAATGGGACCAC-3′;miR-10正向引物為5′-AGCTGTACAAGTAAGGTGGCTCAGAGGAAGA GATT-3′,反向引物為5′-GGGAGAGGGGCTTAGGAACGAGGCGGCTGACCA-3′;U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物為5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′;GAPDH正向引物為5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′,反向引物為5′-GCGCCCAAT ACGACCAAATC-3′。

1.2.3免疫組化 將腫瘤石蠟組織切片并置于65 ℃環(huán)境中進(jìn)行烤片,梯度脫蠟、水化。將切片置于檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中,進(jìn)行抗原修復(fù)。加入5%的正常羊血清封閉15 min。 加入THBS2抗體(1∶800),置于4 ℃環(huán)境中過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗,于37 ℃環(huán)境中孵育30 min。 采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后,以蘇木精室溫染色2 min,進(jìn)行脫水和中性樹脂封片,置于顯微鏡中觀察切片。

1.2.4數(shù)據(jù)庫預(yù)測 采用Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA-GAS5和miR-10的結(jié)合位點(diǎn)(https://starbase.sysu.edu.cn/)及TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-10和THBS2的結(jié)合位點(diǎn)。 (http://www.targetscan.org/vert_71/)。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建lncRNA-GAS5野生型質(zhì)粒PMIR-GAS5-WT和突變型質(zhì)粒PMIR-GAS5-MUT,THBS2野生型質(zhì)粒PMIR-THBS2-WT和突變型質(zhì)粒PMIR-THBS2-MUT。將lncRNA-GAS5野生型/突變型質(zhì)粒與miR-NC和miR-10共轉(zhuǎn)染進(jìn)SiHa細(xì)胞。將THBS2野生型/突變型質(zhì)粒與miR-NC和miR-10共轉(zhuǎn)染進(jìn)SiHa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后,檢測各組細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.2.6CCK8實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后,收集各組SiHa細(xì)胞接種于96孔板。隨后每孔加入10 μL CCK-8溶液,黑暗中孵育2 h后,用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的吸光度(A)。

1.2.7transwell實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長期的各組SiHa細(xì)胞調(diào)整濃度后按4×105/孔分別接種于6孔板。培養(yǎng)1晚后,分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組、GAS5組、miR-10組、THBS2組、GAS5+miR-10組及GAS5+miR-10+THBS2組的SiHa細(xì)胞,再置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞培養(yǎng)液換成不完全培養(yǎng)液饑餓12 h,使胰酶消化細(xì)胞,采用磷酸緩沖鹽(PBS)緩沖液洗滌3次,計(jì)數(shù)并用不完全DMEM培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞,調(diào)整密度為1×106/mL。取24孔板,下室加入650 μL含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液,用鑷子放入8 μm膜孔徑的transwell小室,在每孔上室加入200 μL細(xì)胞懸液,置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)板中取出transwell小室,吸出液體,用干凈的濕棉簽擦凈小室內(nèi)膜上的細(xì)胞,不要碰到下層細(xì)胞。采用PBS緩沖液洗滌小室2遍后,浸入無水乙醇中放置0.5 h。用PBS緩沖液漂洗后將小室反扣于吸水紙上,室溫干燥基底膜。配制結(jié)晶紫染液:取結(jié)晶紫0.05 g溶于甲醇制成0.5%的結(jié)晶紫溶液,用PBS溶液按照1∶5的比例稀釋成0.1%的結(jié)晶紫染液。用結(jié)晶紫染色20 min,PBS緩沖液漂洗2遍,晾干。于倒置顯微鏡下對(duì)非細(xì)胞接種側(cè)拍照。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌組織和癌旁正常組織的lncRNA-GAS5、miR-10和THBS2的表達(dá)水平比較 宮頸癌組織的miR-10表達(dá)水平高于癌旁正常組織(2.45±0.21vs.1.00±0.09,t=10.99,P<0.05),而宮頸癌組織的lncRNA-GAS5表達(dá)水平低于癌旁正常組織(0.34±0.03vs.1.00±0.08,t=-13.38,P<0.05)。宮頸癌組織中THBS2表達(dá)水平低于癌旁正常組織(1.00±0.11vs.3.56±0.42,t=-10.21,P<0.05)。

2.2lncRNA-GAS5、miR-10和THBS2調(diào)控的關(guān)系 將lncRNA-GAS5過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)SiHa細(xì)胞后,GAS5組miR-10表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高 (11.02±1.95vs.1.00±0.08,t=12.576,P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-10后miR-10組的SiHa細(xì)胞中miR-10表達(dá)水平比轉(zhuǎn)染前高(10.33±1.89vs.0.99±0.09,t=12.091,P<0.05)。

經(jīng)Starbase和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA-GAS5的3′-UTR有miR-10的結(jié)合位點(diǎn), miR-10在THBS2的3′-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn),見圖1。相比對(duì)照組,miR-10組PMIR-GAS5-WT及PMIR-THBS2-WT野生型質(zhì)粒熒光素酶活性明顯降低(29.12±3.34vs. 13.51±1.64,t=10.276,P<0.05;27.13±2.78vs. 12.13±1.43,t=11.753,P<0.05),但miR-10組的PMIR-GAS5-WUT及PMIR-THBS2-WUT突變型質(zhì)粒的熒光素酶活性均無明顯變化(29.54±3.65vs. 27.98±2.87,P>0.05;26.65±5.45vs. 25.14±4.76,P>0.05)。

圖1 lncRNA-GAS5、miR-10、THBS2結(jié)合位點(diǎn)圖

2.3lncRNA-GAS5和THBS2對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、遷移的影響 相比對(duì)照組,GAS5組和THBS2組SiHa細(xì)胞的A及侵襲細(xì)胞數(shù)降低,而miR-10組SiHa細(xì)胞的A及侵襲細(xì)胞數(shù)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比miR-10組,GAS5+miR-10組SiHa細(xì)胞的A和細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比GAS5+miR-10組,GAS5+miR-10+THBS2組SiHa細(xì)胞的A和細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1,圖2。

表1 lncRNA-GAS5和THBS2對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、遷移的影響

注:A為對(duì)照組;B為GAS5組;C為miR-10組;D為THBS2組;E為GAS5+miR-10組;F為GAS5+miR-10+THBS2組。

3 討 論

近年來,lncRNA已成為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分,lncRNA 通過與非編碼基因和編碼基因相互作用來調(diào)控疾病的發(fā)病機(jī)制,其中l(wèi)ncRNA-GAS5通過與糖皮質(zhì)激素受體域結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在癌癥研究領(lǐng)域中受到越來越多的關(guān)注[11]。目前有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌和胰腺癌等癌癥中,觀察到lncRNA-GAS5水平異常下降[12]。本研究結(jié)果表明,宮頸癌組織的lncRNA-GAS5表達(dá)水平低于癌旁正常組織(P<0.05)。

近年來關(guān)于lncRNA作用機(jī)制的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA表達(dá)失調(diào)已被證明與多種癌癥的發(fā)展相關(guān)[13],lncRNA可以與微小核糖核酸(miRNA)相互作用影響miRNA的靶基因發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)功能。競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)假說表明,在ceRNA的作用網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA通過自身攜帶的MREs與miRNA的下游靶基因的信使RNA(mRNA)競爭結(jié)合miRNA發(fā)揮調(diào)控作用,當(dāng)lncRNA吸附結(jié)合某個(gè)miRNA后,就能夠?qū)⒃搈iRNA所靶向的mRNA釋放出來,編碼蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),此時(shí)的lncRNA與mRNA即可稱為一對(duì)ceRNA,此揭示了一種RNA間相互作用的新機(jī)制[14]。為了探究lncRNA-GAS5在宮頸癌中的作用,本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-GAS5的3′-UTR有miR-10的結(jié)合位點(diǎn), miR-10在THBS2的3′-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn),這提示THBS2是miR-10的靶基因。本研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中THBS2水平低于癌旁正常組織(P<0.05),提示THBS2具有抑制宮頸癌的功能。WU等[15]研究發(fā)現(xiàn),在SiHa中,THBS2表達(dá)水平下降,并且過表達(dá)THBS2可以抑制miR-221-3p血管生成功能,這與本研究結(jié)果相符。

本研究發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照組,miR-10組PMIR-GAS5-WT及PMIR-THBS2-WT野生型質(zhì)粒熒光素酶活性明顯降低(P<0.05),但miR-10組PMIR-GAS5-WUT及PMIR-THBS2-WUT突變型質(zhì)粒的熒光素酶活性均無明顯變化(P>0.05)。表明lncRNA-GAS5、miR-10、miR-10及THBS2均存在靶向結(jié)合關(guān)系。

本研究通過進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究GAS5+miR-10+THBS2信號(hào)軸對(duì)于宮頸癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照組,GAS5組和THBS2組SiHa細(xì)胞的A及侵襲細(xì)胞數(shù)降低,而miR-10組SiHa細(xì)胞的A及侵襲細(xì)胞數(shù)升高;但相比miR-10組,GAS5+miR-10組SiHa細(xì)胞的A和細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)降低;相比GAS5+miR-10組,GAS5+miR-10+THBS2組SiHa細(xì)胞的A和細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明上調(diào)lncRNA-GAS5的表達(dá)水平能抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,而miR-10恢復(fù)了這種抑制效果。同時(shí),THBS2逆轉(zhuǎn)了miR-10的促進(jìn)增殖、遷移能力。

綜上所述,lncRNA-GAS5的異常表達(dá)可能和宮頸癌有關(guān),lncRNA-GAS5通過抑制miR-10上調(diào)THBS2的表達(dá)水平從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。