ALDH3A1通過IL-6/STAT3信號通路激活GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞上皮間充質轉化

王全凱，金惠萍，李昕葦，崔旭芳，顧軼婷，烏瀚寶櫟爾，康同影，許建寧，*

(1.中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所，北京 100050；2.中國疾病預防控制中心創傷與化學中毒全國重點實驗室，北京 100050)

甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl methacrylate，GMA)，又稱甲基丙烯酸環氧丙酯、甲基丙烯酸-2，3-環氧丙基酯，是一種無色透明、易融于多種有機溶劑的液體。GMA防紫外線、耐水、耐熱等優良特性使其被大量應用于環氧聚合物，牙科和骨科材料等復合材料的合成和改性[1]。早在2009 年，經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)篩選數據集中已將GMA分類為高產量化學品[2]。GMA 的職業暴露和環境釋放通常與其產品制備過程相關且無可避免，在生產或使用GMA的化工廠附近，一般人通過飲用水和食用魚類接觸GMA的機會分別為2.97×10-4和1.34×10-5mg/kg[3]；而在使用含有雙酚A-甲基丙烯酸縮水甘油酯和三乙二醇二甲基丙烯酸酯的牙齒和骨骼復合材料時，包括幼兒在內的患者可能會短期接觸到未反應的GMA 單體[4]。流行病學調查顯示，吸入濃度為32.95 mg/m3時，會對人體造成明顯的毒性反應[5]。國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)根據“強有力”的致癌機制證據及“充分”的實驗證據，將GMA歸類為2A類“對人類很可能致癌”[5]。本課題組既往研究發現，使用GMA 染毒第30 代16HBE 細胞，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)為對照組，GMA 組細胞可在軟瓊脂中形成集落，且細胞在裸鼠成瘤實驗結果陽性，裸鼠皮下腫塊經病理組織學檢查診斷為鱗狀上皮細胞癌，而同時期DMSO 組細胞未形成集落和裸鼠皮下腫塊[6]。但GMA 在蛋白水平上的致癌機制仍不甚明確。

醛 脫 氫 酶 3A1(aldehyde dehydrogenase 3a1，ALDH3A1)是ALDH 超家族的重要成員之一，該家族成員能夠氧化多種內源性和外源性醛類物質為相應的羧酸。近年來，ALDH3A1 已被證明在包括口腔癌[7]、小細胞肺癌[8]等多種癌癥類型中出現明顯的下調表達。ALDH3A1可作為預測惡性腫瘤預后的生物標志物同時其表達水平可能與不良臨床結局相關。范飛飛等[9]以癌癥基因組圖譜(TCGA)中肺腺癌患者的RNA 測序數據為基礎，發現ALDH3A1 在有轉移的肺腺癌患者中明顯高表達，與癌癥干細胞及其上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)特性有關。此外，敲除ALDH3A1 的A549 細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯下降。在口腔鱗狀細胞癌中，ALDH3A1 被證明可通過IL-6/STAT3 信號通路抑制細胞的EMT 過程[7，10]。根據本課題組前期蛋白質組學實驗結果，GMA 誘導的惡性轉化細胞中ALDH3A1 蛋白表達水平是未處理對照細胞的73%，即表達下調了27%，且ALDH3A1 富集到6 個KEGG 通路中，故ALDH3A1 可能為GMA 誘導16HBE 細胞惡性轉化過程中的關鍵差異表達蛋白質。然而，ALDH3A1 能否作為GMA 誘導細胞發生惡性轉化的生物標志物目前尚不清楚。

本研究在課題組既往建立的GMA誘導的惡性轉化16HBE 細胞模型基礎上，使用瞬時轉染技術過表達ALDH3A1，研究GMA 致癌性分子機制，以期明確其與ALDH3A1表達水平的關聯。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

GMA(純度≥98.5%)和DMSO 購于美國Sigma 公司；Lipofectamine 3000 和無血清opti-MEM 培養基購于美國Thermo Fisher 公司；0.25%胰酶-EDTA 購于北京索萊寶科技有限公司；無RNase 水購于北京金克隆科技有限公司；標準胎牛血清購于美國Gibco 公司；TRIzol 試劑購于美國Invitrogen 生命技術有限公司。Western blot 中使用的PageRuler 預染蛋白梯購于美國Thermo Fisher 公司，一抗ALDH3A1、IL-6、STAT3、E-cadherin、MMP3、Snail、Vimentin 購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的IgG 抗體購于碧云天有限公司。

CO2恒溫培養箱購于美國Thermo Fisher 公司；臺式高速低溫離心機購于美國Beckman 公司；倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；熒光顯微鏡購于美國Leica公司；潔凈工作臺購于上海博迅實業有限公司；HH-6-恒溫水浴鍋購于江蘇天瑞電子儀器廠；Infinite 200pro 酶聯免疫檢測儀購于瑞士Tecan 公司；電泳儀購于北京六一生物科技有限公司；全自動化學發光成像系統購于上海天能生命科學有限公司；ViiA 7實時定量PCR反應體系購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 細胞培養

16HBE 細胞為人支氣管上皮細胞，是經SV40 Large T抗原永生化的細胞，保留著正常人器官氣道上皮細胞的特定形態和功能，由美國加利福尼亞大學捐贈。復蘇細胞后，使用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的MEM 培養基，于37 ℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中進行細胞傳代培養。基于本課題組既往GMA 細胞毒性和細胞克隆形成率結果[11]，取對數生長期16HBE 細胞接種于培養瓶中，24 h后向培養液中加入終濃度為8 μg/mL的GMA染毒液，等量DMSO 為溶劑對照。每次染毒時間72 h，間隔24 h 后進行第2 次染毒，重復染毒3 次后結束染毒，細胞記為第0代(P0)，更換為含有5% FBS的MEM培養基繼續培養，每3 d 換液1 次，每5 d 傳代1 次，傳代過程中收取第40 代(P40)GMA 處理組和同代齡DMSO 對照組細胞，經多種實驗鑒定，P40 GMA(8 μg/mL)處理組細胞已完成惡性轉化過程，惡性轉化特征顯著且穩定，可用于后續ALDH3A1 功能和作用機制的探索和研究[12]。

1.3 質粒構建與細胞轉染

過表達質粒構建通過將人ALDH3A1 cDNA 插入質粒載體GV658中獲得，通過DNA測序證實其構建成功。ALDH3A1過表達質粒和對照質粒均由中國上海吉凱化學股份有限公司合成。構建ALDH3A1 過表達質粒的引物序列見表1。

表1 構建ALDH3A1過表達質粒使用的引物列表

1.4 Western blot檢測

提取各組細胞總蛋白，BCA 法蛋白定量后進行SDS-PAGE 電泳，使用PageRuler 預染蛋白梯作為標準。5%的脫脂牛奶封閉PVDF 膜(0.45 μm)，TBST 緩沖液沖洗3 次，每次5 min，然后分別加入一抗ALDH3A1、 IL-6、 STAT3、 E-cadherin、 MMP3、Snail、Vimentin(1∶1 000稀釋) 4 ℃孵育過夜，內參抗體為GAPDH。次日，使用辣根過氧化物酶標記的IgG抗體作為二抗(1∶1 000 稀釋)室溫孵育1 h 后用TBST再次清洗膜3次，ECL試劑處理膜后曝光成像。

1.5 實時熒光定量PCR

實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qPCR)對所選基因的表達進行定量分析。qPCR使用2×Hieff Canace PCR 母液(10136ES01，YEASEN，中國)，在Bio-Rad CFX(Bio-Rad，美國)儀上進行40次熱循環，退火溫度均為60 ℃，使用管家基因β-actin作為內參，引物序列見表2。采用比較CT法對目的基因表達進行相對定量(△△CT法)，目的基因的表達水平與內參基因的表達進行歸一化處理。每組進行3次重復。

1.6 統計分析

數據和圖表使用SPSS 23.0 軟件處理并進行統計分析，數據用±s表示，組間比較采用雙側t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。采用ImageJ 軟件處理蛋白質條帶圖。采用GraphPad Prism軟件完成文章中圖表繪制。

2 結 果

2.1 ALDH3A1 在GMA 誘導的惡性轉化16HBE 細胞中的表達

使用Western blot 和qPCR 法檢測GMA 誘導的惡性轉化16HBE 細胞與DMSO 對照組細胞中ALDH3A1的表達情況，以驗證既往課題組蛋白質組學結果，即GMA 誘導的惡性轉化細胞中ALDH3A1 是未處理對照細胞的73%(P＜0.01)。如圖1，與對照組相比，惡性轉化細胞中ALDH3A1 mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.01)，與蛋白質組學結果一致，提示ALDH3A1可能在GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞中發揮作用。

圖1 ALDH3A1在GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞中的表達

2.2 瞬時轉染過表達ALDH3A1細胞的驗證

為進一步明確ALDH3A1 在GMA 誘導的惡性轉化16HBE細胞中的作用，采用瞬時轉染技術過表達惡性轉化細胞中的ALDH3A1，并采用Western blot和qPCR分析確認。結果如圖2，實驗中細胞轉染效率較高，與空質粒組細胞相比，基因和蛋白表達水平在ALDH3A1 過表達組細胞中顯著增加(P＜0.01)。因此，本研究中構建的ALDH3A1 瞬時過表達惡性轉化16HBE細胞可用于進一步的實驗。

圖2 瞬時轉染后GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞中ALDH3A1的表達情況

2.3 過表達ALDH3A1 抑制GMA 誘導的惡性轉化16HBE細胞EMT過程

為進一步探究ALDH3A1 對GMA 誘導的惡性轉化16HBE 細胞EMT 過程的影響，使用Western blot 和qPCR 技術檢測惡性轉化16HBE 細胞和對照組細胞中EMT 過 程 標 志 蛋 白(E-cadherin、Vimentin、Snail、MMP3)的表達變化。如圖3A 和3B 所示，與對照組細胞相比，惡性轉化16HBE 細胞中E-cadherin 和Vimentin 的蛋白表達及轉錄水平分別出現顯著的下調及上調(P＜0.01)。而與空質粒對照組細胞相比，ALDH3A1 過表達細胞中E-cadherin 表達上調，Vimentin、MMP3、Snail 表達及轉錄水平則顯著下降(P＜0.01)。上述結果提示ALDH3A1在GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞中可能具有抑制EMT過程的作用。

圖3 ALDH3A1在GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞中抑制EMT過程

2.4 ALDH3A1 過表達抑制GMA 誘導的惡性轉化16HBE細胞中IL-6/STAT3通路激活

為進一步明確ALDH3A1 影響GMA 誘導的惡性轉化16HBE 細胞EMT 過程的潛在機制，使用Western blot 和qPCR 分析確定ALDH3A1 過表達對IL-6/STAT3通路的影響。如圖4A 所示，與對照組相比，惡性轉化16HBE細胞中STAT3表達水平顯著提高，而STAT3蛋白表達雖未出現明顯改變但其磷酸化水平顯著提高(P＜0.01)。然而在ALDH3A1 過表達組細胞中，IL-6、STAT3、p-STAT3 表達受到抑制，IL-6、STAT3 的轉錄水平也呈現顯著降低(P＜0.01)。結果提示，IL-6/STAT3 通路的抑制可能參與到ALDH3A1 在GMA 誘導的惡性轉化16HBE細胞中抑制EMT過程。

圖4 ALDH3A1在GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞中對IL-6/STAT3信號通路相關蛋白表達水平的影響

3 討 論

在眾多的癌癥致病因素中，約90%以上是化學因素，而各種化學物質廣泛存在于多種環境介質中[13]。然而作為一種明確“可能對人類致癌”的化學物質，GMA對人類的致癌性證據依然十分有限。由于人類流行病學調查數據難以獲得，因此，基于相應致癌分子機制的研究對判斷GMA可能的人類致癌性則顯得更為重要。20 世紀80 年代開始，課題組先后對GMA 的致畸性、致突變性和致癌性進行了一系列的研究[14]。軟瓊脂克隆形成實驗和刀豆蛋白凝集素A(conanavalin A，ConA)凝集實驗表明經GMA 誘導發生形態改變的金倉鼠胚胎細胞已獲得惡性轉化細胞特征，提示GMA能夠誘發金倉鼠胚胎細胞惡性轉化[15]。裸鼠皮下接種GMA 誘導的惡性轉化BALB/c 3T3 細胞后，可形成分化程度較低的纖維肉瘤[16]。上述結果說明，GMA誘導的惡性轉化16HBE 細胞模型已成功建立，可用于GMA的致癌性機制研究。

ALDH3A1 作為NAD(P)+依賴性酶組成的ALDH 超家族的重要成員，通過將多種醛氧化成羧酸的方式調節正常細胞和腫瘤細胞中增殖、分化、存活和對氧化應激的反應等功能[17-18]。ALDH3A1 已被證明在幾種癌癥類型中表達下調，在Patel 等[8]的報道中，與正常肺組織相比，ALDH3A1在小細胞肺癌組織中的表達水平更低，且ALDH3A1 過度表達與腫瘤進展或預后可能呈現負相關[1，19-20]。但也有文獻表明，大鼠肝細胞胞質ALDH3A1由多環芳烴氯化化合物誘導會在致癌過程中增加，因此ALDH3A1在GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中表達降低的相關作用機制仍需進一步的研究和探討。

細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是一種由細胞分泌的非細胞成分，可以為細胞提供必要的結構和生化支持。癌細胞轉移是一個復雜的過程，其中多個步驟均有ECM 的參與，包括腫瘤組織的細胞分離，細胞活性調節，并通過淋巴系統或血管侵襲，增殖和逃逸等[21]。近年來，EMT 在腫瘤侵襲和轉移中的重要作用已得到充分驗證，Zhao等[22]報告了EMT促進上皮樣腫瘤細胞獲得侵襲潛力，促進細胞通過血液或淋巴系統的運輸。在大多數腫瘤中，上皮細胞E-cadherin的表達減少和Vimentin、MMP3、Snail 的表達增加被認為是腫瘤轉移和侵略性增加的關鍵標志[23]。在我們的研究中，GMA 誘導的惡性轉化16HBE 細胞中E-cadherin 表達下調，Vimentin 表達上調，提示ALDH3A1 可通過調控EMT 過程中相關E-cadherin、Vimentin的表達，激活GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞的EMT過程。

IL-6 通過與IL-6 受體結合后，Janus 激酶(JAK)就會被激活，STAT3 被磷酸化，通過2 個單體之間的相互SH2 結構域-磷酸酪氨酸相互作用形成同源二聚體，并轉移到細胞核中，從而在細胞質和細胞核之間交換信號，與靶基因的啟動子區域結合，激活EMT相關基因轉錄，參與癌細胞的抗凋亡、血管生成、增殖、侵襲、轉移和耐藥性的過程[24-26]。異常的IL-6/STAT3 信號通路在腫瘤發生和發展中起著至關重要作用，目前已在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多種癌癥中檢測到IL-6/STAT3 信號通路的持續激活[27-28]。為了明確GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞中ALDH3A1 如何影響其EMT 過程，我們檢測了IL-6/STAT3 通路相關蛋白的表達，結果發現惡性轉化細胞中ALDH3A1 表達降低的同時IL-6/STAT3 通路被激活。上述結果提示，上調ALDH3A1 可以通過IL-6/STAT3信號通路有效抑制GMA誘導的惡性轉化16HBE細胞的EMT過程。

ALDH3A1 與GMA 誘導16HBE 細胞惡性轉化過程密切相關，IL-6/STAT3通路激活促使惡性轉化細胞上皮間充質轉化能力增加，從而在GMA 誘導16HBE 細胞惡性轉化過程發生作用。本研究的結果將有助于闡明GMA的致癌機制。